[发明专利]一种核壳磷酸钙多肽复合纳米疫苗及其制备方法

说明书

本发明公开了一种核壳磷酸钙多肽复合纳米疫苗及其制备方法，核壳磷酸钙多肽复合纳米疫苗，包含CaP@多肽@CaP@CpG纳米颗粒，多肽为在中性溶液中带负电的抗原多肽；本发明的方法得到的疫苗的核壳结构磷酸钙具有巧妙的结构，实现可满足抗原多肽和佐剂分子共运输的要求，可有效保护抗原多肽；本发明得到的纳米颗粒具有很好的颗粒稳定性，不产生明显的聚集；且对于带负电的多肽具有较高的包封率；制备方法简单、纯水相合成，绿色安全。

技术领域

本发明涉及生物医药领域，特别是一种核壳磷酸钙多肽复合纳米疫苗及其制备方法。

背景技术

肿瘤免疫治疗被认为是一项极具前景的技术。通过抗原递呈细胞，尤其是作为免疫第一防线的树突状细胞(DC)吞噬抗原并将多肽加工递呈到其表面，与MHCⅠ类分子或者Ⅱ类分子结合，从而有效的激活T细胞，诱导和产生强大的CD8+和CD4+T细胞，进而有效的杀伤肿瘤细胞。然而单一的裸肽疫苗由于在体内容易被分解，往往面临着免疫原性低的局限。因此发展适合的抗原分子递送系统具有重要的应用价值。

磷酸钙(CaP)是人体内骨骼的主要成分之一，具有很好的生物相容性及安全性。磷酸钙纳米颗粒被认为是一种极具前景的递送系统，尤其在核酸类物质递送领域有着巨大的应用前景。磷酸钙本身具有几个特点：1)本身带有较强正电荷，因此可以有效的复合核酸类物质，例如siRNA、mRNA、dsDNA等。2)磷酸钙耐碱不耐酸，因此当磷酸钙纳米颗粒被DC细胞吞噬，它会在酸性的内涵体或者溶酶体中分解，由于内涵体内离子浓度的升高，造成内涵体破裂，从而有效的将负载的分子释放到细胞质中。

然而，不同于核酸类物质，多肽抗原尤其是新生抗原，多肽性质各异，多肽本身不具有核酸类物质天然的与磷酸钙的结合优势。目前，基于磷酸钙的多肽复合纳米疫苗尚未得到系统的开发。现有技术有用磷酸钙颗粒原位包裹蛋白质，并未共负载可以进一步刺激免疫原性的佐剂分子。此外，磷酸钙颗粒由于表面具有较多的参与电荷，因此容易发生凝聚或者聚集，无法得到稳定分散的悬液。为此人们常采用磷脂双分子层修饰或者高分子层修饰CaP的策略，然而复杂的操作步骤以及引入的有机溶剂无疑不利于CaP复合载体系统的开发；市场需要一种具有核壳结构磷酸钙的巧妙结构，可满足抗原多肽和佐剂分子共运输的要求；方法简单、纯水相合成，绿色安全的核壳磷酸钙多肽复合纳米疫苗，本发明解决这样的问题。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种核壳磷酸钙多肽复合纳米疫苗及其制备方法，本发明的疫苗的核壳结构磷酸钙具有巧妙的结构，实现可满足抗原多肽和佐剂分子共运输的要求，具有很好的颗粒稳定性，不产生明显的聚集；且对于带负电的多肽具有较高的包封率。

为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：

一种核壳磷酸钙多肽复合纳米疫苗，包含CaP@多肽@CaP@CpG纳米颗粒。

前述的一种核壳磷酸钙多肽复合纳米疫苗，多肽为在中性溶液中带负电的抗原多肽。

前述的一种核壳磷酸钙多肽复合纳米疫苗，CpG的序列为：TCC ATG ACG TTC CTGACG TT SEQ NO 03。

一种核壳磷酸钙多肽复合纳米疫苗的制备方法，包括如下步骤：

步骤一，将抗原多肽分子及钙盐水溶液混合，并在室温下放置10min-60min；

步骤二，将磷酸盐水溶液逐滴加入到上述多肽/钙盐混合液中，并通过搅拌方式在室温下反应10min-120min，得到CaP@peptide颗粒；

步骤三，由于多肽分子可以参与CaP的矿化过程，因此该步骤可以将多肽分子包裹到CaP内部；

步骤四，通过高速离心的方式收集CaP@peptide颗粒，并将该颗粒重新分散到钙盐水溶液中，并在室温下放置10min-60min之后，继续加入磷酸盐溶液，得到CaP@多肽@CaP颗粒；