[发明专利]缺失丙二酸半醛旁路代谢路径脱氮假单胞菌的构建方法

权利要求书

1.缺失丙二酸半醛旁路代谢路径脱氮假单胞菌的构建方法，其特征在于，包括：

(1)从已构建的脱氮假单胞菌ZAP01出发，在该菌株基因组DNA中分别单独和组合敲除mmsAI，mmsAII、mmsAIII和BAPAT基因，获得若干突变菌株；

(2)通过构建质粒pUCPK-AM，过表达3-HP合成路径相关酶转化乙酸生产3-HP；

(3)在含有30mg/L的卡那霉素LB平板上筛选获得目标突变重组菌。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)包括：

从已构建的脱氮假单胞菌ZAP01出发，在该菌株基因组DNA中分别单独和组合敲除mmsAI，mmsAII、mmsAIII和BAPAT基因，获得突变菌株ZAP01ΔmmsAI、ZAP01ΔmmsAII、ZAP01ΔmmsAIII、ZAP01ΔBAPAT、ZAP01ΔmmsAIΔmmsAIIΔmmsAIII和ZAP01ΔmmsAIΔmmsAIIΔmmsAIIIΔBAPAT。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)包括：

构建质粒pUCPK-AM，利用电穿孔仪将pUCPK-AM质粒通过电转化分别转入到突变菌株ZAP01ΔmmsAI、ZAP01ΔmmsAII、ZAP01ΔmmsAIII、ZAP01ΔBAPAT、ZAP01ΔmmsAI、ZAP01ΔmmsAIΔmmsAIIΔmmsAIII和ZAP01ΔmmsAIΔmmsAIIΔmmsAIIIΔBAPAT中。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述电转化所用电极条件为25μF，200Ω，180V，电击杯宽度为2mm。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)包括：

将突变重组菌分别在LB平板上过夜培养；

从该新鲜平板上单菌落接种到含有10mL种子培养基的50mL三角瓶中，37℃、250rpm培养12小时，所得种子液OD600值为3-4；

然后分别以接种后OD600＝0.1的接种量将各菌株种子液接种到50mL发酵培养基中，发酵采用250mL三角瓶，控制温度37℃、250rpm，补料发酵，在9h、24h，31h和35h分别补料3g/L、4g/L、4g/L和4g/L的乙酸钠，发酵时间48小时；

对比3-HP的产量和产率，选出最优目标菌株。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述种子培养基的配方为：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母膏，10g/L氯化钠。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基的配方是：100mmol/L磷酸缓冲液(pH7.0)、8g/L乙酸钠、0.25g/L硫酸镁、1g/L氯化铵、1g/L酵母膏。