[发明专利]缺失丙二酸半醛旁路代谢路径脱氮假单胞菌的构建方法

说明书

缺失丙二酸半醛旁路代谢路径脱氮假单胞菌的构建方法，包括：(1)从已构建的脱氮假单胞菌ZAP01出发，在该菌株基因组DNA中分别单独和组合敲除mmsAI，mmsAII、mmsAIII和BAPAT基因，获得若干突变菌株；(2)通过构建质粒pUCPK‑AM，过表达3‑HP合成路径相关酶转化乙酸生产3‑HP；(3)在含有30mg/L的卡那霉素LB平板上筛选获得目标突变重组菌。本发明的方法通过在脱氮假单胞菌中敲除丙二酸半醛脱氢酶和β‑丙氨酸‑丙酮酸转氨酶，完全阻断丙二酸半醛支路代谢路径，使更多的丙二酸半醛用于3‑HP的合成，从而提高乙酸合成3‑HP的产量。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一株缺失丙二酸半醛旁路代谢路径脱氮假单胞菌的构建方法。

背景技术

丙二酰辅酶A合成3-羟基丙酸(3-HP)的代谢路径是目前具有较高前景的生物合成3-HP的主要路线。胞内丙二酰辅酶A由乙酰辅酶A羧化酶(ACC)羧化乙酰辅酸半醛脱氢酶(MCRN))的作用下合成3-HP。实验室前期在脱氮假单胞菌ZAP中通过过表达ACC、MCRC和MCRN构建了一株经由丙二酰辅酶A路径代谢乙酸生物合成3-HP的重组菌株。但是，该菌转化乙酸合成3-HP的得率低下。乙酸活化生成中间代谢物乙酰辅酶A后，依次生成中间产物丙二酰辅酶A和丙二酸半醛。中间产物乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A还分别是进入中心代谢TCA循环和脂肪酸合成的必酶A而形成，丙二酰辅酶A经过丙二酸单酰辅酶A还原酶(MCRC)生成丙二酸半醛，丙二酸半醛在丙二要物质，不能完全阻断而只能通过下调TCA循环和脂肪酸合成的活性来增大乙酸合成3-HP的代谢通量；而中间产物丙二酸半醛是β-丙氨酸代谢的产物，β-丙氨酸作为碳源时，假单胞菌可以通过转氨基酶将其转化为丙二酸半醛；然后丙二酸半醛被NAD+依赖的丙二酸半醛脱氢酶氧化为乙酰辅酶A。完全阻断丙二酸半醛脱氢酶可以提高乙酸合成3-HP的代谢通量。假单胞菌中NAD+-依赖的丙二酸半醛脱氢酶催化丙二酸半醛可转化为两种不同的产物，这取决于CoA作为共底物的可用性。在CoA存在的情况下，丙二酸半醛转化为乙酰辅酶A和碳酸氢盐，但在没有CoA的情况下，丙二酸半醛会较慢的反应，最终生成乙酸盐。另外，假单胞菌可以通过β-丙氨酸-丙酮酸转氨酶催化底物丙二酸半醛合成β-丙氨酸。

发明内容

本发明的目的在于一种缺失丙二酸半醛旁路代谢路径脱氮假单胞菌的构建方法，通过在脱氮假单胞菌中敲除丙二酸半醛脱氢酶(由mmsA基因编码)和β-丙氨酸-丙酮酸转氨酶(由BAPAT基因编码)，完全阻断丙二酸半醛支路代谢路径，使更多的丙二酸半醛用于3-HP的合成，从而提高乙酸合成3-HP的产量。

为实现上述发明目的，本发明的技术方案具体如下：

缺失丙二酸半醛旁路代谢路径脱氮假单胞菌的构建方法，包括：

(1)从已构建的脱氮假单胞菌ZAP01出发，在该菌株基因组DNA中分别单独和组合敲除mmsAI，mmsAII、mmsAIII和BAPAT基因，获得若干突变菌株；

(2)通过构建质粒pUCPK-AM，过表达3-HP合成路径相关酶转化乙酸生产3-HP；

(3)在含有30mg/L的卡那霉素LB平板上筛选获得目标突变重组菌。

进一步的，所述步骤(1)包括：

从已构建的脱氮假单胞菌ZAP01出发，在该菌株基因组DNA中分别单独和组合敲除mmsAI，mmsAII、mmsAIII和BAPAT基因，获得突变菌株ZAP01ΔmmsAI、ZAP01ΔmmsAII、ZAP01ΔmmsAIII、ZAP01ΔBAPAT、ZAP01ΔmmsAIΔmmsAIIΔmmsAIII和ZAP01ΔmmsAIΔmmsAIIΔmmsAIIIΔBAPAT。

进一步的，所述步骤(2)包括：