[发明专利]一种生产CBGA前体的酿酒酵母工程菌及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种生产橄榄酸的酿酒酵母工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)构建能够同时表达四酮合酶、橄榄酸环化酶和酰基激活酶的重组表达载体2；

(2)制备硫酯水解酶基因被敲除酿酒酵母感受态细胞1；

(3)将步骤1得到的重组表达载体2转化至酿酒酵母感受态细胞1；获得生产橄榄酸的酿酒酵母工程菌；

所述酰基激活酶表达基因为AtAAE1，所述AtAAE1的基因序列如SEQ ID NO.7或SEQ IDNO.11所示；

所述硫酯水解酶基因为Eht1，Eeb1及Mgl2。

2.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，所述硫酯水解酶基因敲除包括以下步骤：

(3.1)构建靶向敲除硫酯水解酶的引导RNA表达载体；

(3.2)将步骤3.1得到的引导RNA表达载体转化至酿酒酵母感受态细胞，获得突变菌株感受态细胞；

(3.3)将所述重组表达载体2转化至步骤3.2得到的突变菌株感受态细胞，获得生产橄榄酸的酿酒酵母工程菌。

3.一种生产橄榄酸的酿酒酵母工程菌，其特征在于，所述酿酒酵母工程菌通过权利要求1～2任一项所述构建方法构建得到。

4.一种生产橄榄酸的方法，包括如下步骤：

(1)构建如权利要求3所述生产橄榄酸的酿酒酵母工程菌；

(2)发酵培养步骤(1)中生产橄榄酸的酿酒酵母工程菌，得到发酵培养产物；

(3)将步骤(2)中得到的发酵培养产物进行提取纯化，得到橄榄酸。

5.根据权利要求4所述生产橄榄酸的方法，其特征在于，所述硫酯水解酶基因敲除包括以下步骤：

(3.1)构建靶向敲除硫酯水解酶的引导RNA表达载体；

(3.2)将步骤3.1得到的引导RNA表达载体转化至酿酒酵母感受态细胞1，获得突变菌株感受态细胞。

6.一种CBGA的制备方法，其特征在于，包含如下步骤：

(1)构建表达四酮合酶、橄榄酸环化酶和酰基激活酶的酿酒酵母工程菌，所述酰基激活酶能在酿酒酵母体内催化己酰辅酶A的生成；所述酰基激活酶基因为AtAAE1；

(2)在由步骤(1)得到的酿酒酵母工程菌中，通过所述酰基激活酶催化己酸生成己酰辅酶A，进而在四酮合酶、橄榄酸环化酶的催化下生成橄榄酸；

(3)通过由步骤(2)生成的橄榄酸，制备得到CBGA；

其中，步骤(1)中的酿酒酵母工程菌的构建方法包括如下步骤：

(1)构建能够同时表达四酮合酶、橄榄酸环化酶和酰基激活酶的重组表达载体；

(2)制备硫酯水解酶基因被敲除酿酒酵母感受态细胞；

(3)将步骤(1)得到的重组表达载体转化至酿酒酵母感受态细胞；获得所述酿酒酵母工程菌；

敲除的硫酯水解酶基因为Eht1、Eeb1及Mgl2；

所述AtAAE1的基因序列如SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.11所示。

7.根据权利要求6所述CBGA的制备方法，其特征在于，所述硫酯水解酶基因敲除包括以下步骤：

构建靶向敲除硫酯水解酶的引导RNA表达载体；

将得到的所述引导RNA表达载体转化至酿酒酵母感受态细胞，获得突变菌株感受态细胞。