[发明专利]一种生产CBGA前体的酿酒酵母工程菌及其构建方法和应用

说明书

本发明涉及一种生产CBGA前体的酿酒酵母工程菌及其构建方法和应用，其中通过构建了能够同时表达四酮合酶、橄榄酸环化酶和酰基激活酶的重组表达载体，并将其转化至硫酯水解酶基因被敲除酿酒酵母感受态细胞，获得生产CBGA前体的酿酒酵母工程菌。该酿酒酵母工程菌通过优化酰基激活酶的表达和下调硫酯水解酶的表达，可有效提高菌株的OA产量，预测可同步提高己酰辅酶A的产量，为后续进一步构建新的高效合成CBGA前体OA菌株奠定基础。

技术领域

本发明涉及代谢工程技术领域，具体而言，特别是涉及一种生产CBGA前体的酿酒酵母工程菌及其构建方法和应用。

背景技术

脂酰辅酶A对植物的生命活动至关重要，例如乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A均是合成脂肪酸的必需底物。长链脂酰辅酶A在植物木质素、磷脂、三酰甘油、茉莉酸生成及脂肪酸β-氧化等诸多生命活动中起着关键作用[J.M.Shockey，M.S.Fulda，J.A.Browse，ArabidopsisContains Nine Long-Chain Acyl-Coenzyme A Synthetase Genes That Participate inFatty Acid and Glycerolipid Metabolism，Plant Physiology，129(2002)1710-1722；J.M.Stout，Z.Boubakir，S.J.Ambrose，R.W.Purves，J.E.Page，The hexanoyl-CoAprecursor for cannabinoid biosynthesis is formed by an acyl-activating enzymein Cannabis sativa trichomes，The Plant Journal，71(2012)353-365.]。植物中短链脂酰辅酶A能够作为底物参与多种重要次生代谢产物的生成，与人类健康有着密不可分的联系。啤酒中特有风味的来源-苦味酸合成前体就是异戊酰辅酶A、丁酰辅酶[H.Xu，F.Zhang，B.Liu，D.V.Huhman，L.W.Sumner，R.A.Dixon，G.Wang，Characterization of theFormation of Branched Short-Chain Fatty Acid：CoAs for Bitter AcidBiosynthesis in Hop Glandular Trichomes，Mol.Plant，6(2013)1301-1317.]；己酰辅酶A是大麻萜酚酸(Carmabigerolic acid，CBGA)的底物。CBGA因其具有刺激脂质代谢、减轻结肠炎、诱导结肠癌细胞凋亡及减少炎症等药理功效作为药物新宠正被越来越多的医学、科研工作者追捧。自然界中多种次生代谢产物的变体往往比内源化合物的药用活性更高。如CBGA己酰支链的变体庚酰支链活性比己酰支链生成的CBGA在药理功效上活性更高。

大麻中CBGA的生物合成途径已解析清楚。其合成途径主要分三步：酰基基团的生成，间苯三酚化合物(Olivetolic acid，OA)的生成及异戊烯基修饰。上游酰基基团的含量直接影响到下游OA及CBGA的产量。

植物脂酰辅酶A的生成是由酰基激活酶(Acyl-activity enzyme，AAE)催化产生的，例如啤酒花中H1CCL2能够催化异戊酰辅酶A的生成，H1CCL4能够催化异丁酰辅酶A和丁酰辅酶A的生成。大麻中CsAAE1能够催化己酰辅酶A的生成。迄今为止，除CsAAE1之外，还没有其他AAE基因能够在酵母体内催化己酰辅酶A生成并进一步产生OA和CBGA的报道。因此，找寻能够催化己酰辅酶A生成、从而进一步生成CBGA的酰基激活酶对于在酵母中提高CBGA的产量起很重要作用。