[发明专利]一种基于超滤离心法获取外泌体的制备方法

权利要求书

1.一种基于超滤离心法获取外泌体的制备方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：

S1、样品溶液的获取：在无菌工作台上取出脐带标本置于一次性无菌培养皿中，使用PBS充分洗涤后，剔除动静脉血管，将华通氏胶接种于培养瓶中，加入足量完全培养基，于37℃、体积分数为5%的CO2细胞培养箱中培养，当细胞达到70%-80%融合时，传代培养至第4代，选择生长状态良好的第4代脐带间充质干细胞，用含体积分数为10%胎牛血清的低糖DMEM培养基培养，待细胞融合至70%-80%时换无血清培养基培养，使用PBS溶液冲洗1-2次，继续培养48-72 h后收集条件培养基，将收集所得上清液经过0.22 μm一次性滤器后，收集上清液，获得样品溶液；

S2、样品离心管的制作：将步骤S1中所述的样品溶液添加至微过滤器中，向专用离心管底部填充提取液，使用孔隙为0.22μm的滤膜覆盖在提取液液面上端，将微过滤器放置于专用离心管的中部，使用固定装置将微过滤器的位置进行预固定，在室温条件下向专用离心管与微过滤器之间填充凝胶，并轻微振荡使凝胶完全填充至专用离心管、微过滤器与滤膜之间的缝隙中，待凝胶液面与微过滤器上端水平时，将专用离心管放置于0℃环境下冷藏，待凝胶完全凝固后，使用封口将专用离心管上端开口密封，得到样品离心管；

S3、外泌体的获取：将步骤S2中所述的样品离心管置于超速离心机中，于2000×g环境下离心20min，然后于10000×g环境下离心30min，最后于100000×g环境下离心70min，得到外泌体与提取液的混合液，经提纯后获取形态均匀且高纯度的外泌体。

2.根据权利要求1所述的一种基于超滤离心法获取外泌体的制备方法，其特征在于：所述的微过滤器为空心圆柱结构，所述的微过滤器内部设有垂直分布的两层超滤膜，且位于上侧的超滤膜的孔径为0.22μm-0.4μm，孔隙率为80%-95%，位于下侧的超滤膜的孔径为0.1μm-0.2μm，孔隙率为80%-95%。

3.根据权利要求1所述的一种基于超滤离心法获取外泌体的制备方法，其特征在于：所述的专用离心管为组合式结构，所述的专用离心管上部为空心圆柱，下部为圆锥管，且上部与下部之间通过螺纹连接，所述的提取液填充在圆锥管内部。

4.根据权利要求1所述的一种基于超滤离心法获取外泌体的制备方法，其特征在于：所述的凝胶为体积分数2%琼脂糖凝胶。

5.根据权利要求1所述的一种基于超滤离心法获取外泌体的制备方法，其特征在于：所述的微过滤器下端与滤膜之间的距离不小于2cm。