[发明专利]一种基于超滤离心法获取外泌体的制备方法

说明书

本发明公开了一种基于超滤离心法获取外泌体的制备方法，包括样品溶液的获取、样品离心管的制作和外泌体的获取三个步骤。以脐带或者胎盘为原料制作的样品溶液经过三个连续的离心处理阶段，可以得到形态均匀、纯度较高的外泌体，同时在现有的离心管基础上进行改进，提出组合式结构的专用离心管和微过滤器，并使用凝胶进行填充制作而成的样品离心管，并使用自制的样品离心管进行外泌体的提取，使得整个提取过程均在离心机里进行，无需再经过离心‑过滤再离心等多个流程，简化了提取的操作步骤，便于实现大量提取，提高了外泌体提取效率。

技术领域

本发明涉及外泌体制备领域，特别涉及一种基于超滤离心法获取外泌体的制备方法。

背景技术

外泌体是指包含了复杂 RNA 和蛋白质的小膜泡 (30-150nm)，现今，其特指直径在40-100nm的盘状囊泡。1983年，外泌体首次于绵羊网织红细胞中被发现。多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体。其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中 。外泌体被视为特异性分泌的膜泡，参与细胞间通讯，对外泌体的研究兴趣日益增长，无论是研究其功能还是了解如何将其用于微创诊断的开发。

外泌体是一个大小约几十纳米的囊状小体，大于一般蛋白质，但由于脂蛋白的尺寸、密度和外泌体囊泡均有重叠，因此在外泌体提取过程中，脂蛋白为主要存在的杂质之一，目前尚没有一种方法可以获得纯的细胞外囊泡，外泌体的提取方法较多，但提取的外泌体含量、纯度、活性均存在一定程度的不同，各有优缺点，目前，普遍采用的方法有离心法、超滤法、沉淀法和免疫法，其中离心法又包含超速离心法和密度梯度离心法，超速离心法是外泌体分离的金标准，耗时少，获得的外泌体产量和纯度高，但重复的超速离心可能会降低外泌体的质量及产量。

因此，在超速离心法的基础上，又提出了超滤离心法，其原理是利用不同截留相对分子质量的超滤膜对样品进行选择性分离，便可获得外泌体。超滤离心法简单高效，且不影响外泌体的生物活性，是提取细胞外泌体的一种新方法，但以脐带或者胎盘为原料使用超滤离心法提取间充质干细胞来源的外泌体时，存在两个问题，问题一：使用超滤离心法提取外泌体需要利用特殊的装置，且需要经历多次过滤，操作复杂；问题二：由于如高尔基体、内质网、微小的质膜残片等小于膜孔的非外泌体成分或灵活性好的混杂蛋白可通过滤过膜，从而引起外泌体纯度不足，为此，我们提出一种基于超滤离心法获取外泌体的制备方法。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种基于超滤离心法获取外泌体的制备方法，以脐带或者胎盘为原料制作的样品溶液经过三个连续的离心处理阶段，可以得到形态均匀、纯度较高的外泌体，同时在现有的离心管基础上进行改进，提出组合式结构的专用离心管和微过滤器，并使用凝胶进行填充制作而成的样品离心管，并使用自制的样品离心管进行外泌体的提取，使得整个提取过程均在离心机里进行，无需再经过离心-过滤再离心等多个流程，简化了提取的操作步骤，便于实现大量提取，提高了外泌体提取效率，可以有效解决背景技术中的问题。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种基于超滤离心法获取外泌体的制备方法，该方法包括如下步骤：

S1、样品溶液的获取：在无菌工作台上取出脐带标本置于一次性无菌培养皿中，使用PBS充分洗涤后，剔除动静脉血管，将华通氏胶接种于培养瓶中，加入足量完全培养基，于37℃、体积分数为5%的CO2细胞培养箱中培养，当细胞达到70%-80%融合时，传代培养至第4代，选择生长状态良好的第4代脐带间充质干细胞，用含体积分数为10%胎牛血清的低糖DMEM培养基培养，待细胞融合至70%-80%时换无血清培养基培养，使用PBS溶液冲洗1-2次，以去除胎牛血清中含有的蛋白影响，继续培养48-72 h后收集条件培养基，将收集所得上清液经过0.22 μm一次性滤器后，以去除上清液中的死细胞和较大的杂质，收集上清液，获得样品溶液；