[发明专利]二次两级切向流分离纯化和浓缩外泌体的超滤装置及方法

说明书

本发明提供了一种二次两级切向流分离纯化和浓缩外泌体的超滤装置，包括以及通过管路连接的第一级切向流超滤系统、第二级切向流超滤系统、蠕动泵和循环泵，所述蠕动泵和循环泵用于驱动所述超滤装置内部的液体流动；且所述第一级切向流超滤系统和所述第二级切向流超滤系统内分别设置有第一过滤膜以及第二过滤膜，所述第二过滤膜的过滤孔孔径小于所述第一过滤膜的过滤孔孔径。本发明还提供一种二次两级切向流分离纯化和浓缩外泌体的超滤方法，包括对待提取液的循环超滤，最终制得高纯度的外泌体，本发明有较高的推广价值与商业价值。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种二次两级切向流分离纯化和浓缩外泌体的超滤装置及方法。

背景技术

目前，外泌体的分离富集提取方法主要靠人工操作，主要技术方法包括离心、沉淀、超滤、免疫亲和及微流控等，随着科学技术的发展和人们健康观念和追求美的观念的普及，外泌体市场需求变大，传统外泌体分离技术方法规模化提取分离与纯化受限产能不足，造成外泌体供不应求，因此外泌体规模化生产迫在眉睫。

超速离心一直被视为分离提取外泌体的金标准。该方法根据沉降系数、大小和形状多次差速离心来进行分离得到外泌体。先收集间充质干细胞(MSC)培养基上清液，先在4℃条件下，300g-500g离心10分钟，得到上清液1和沉淀1，这一步骤是为了去除活细胞；接下来对上清液1在4℃条件下2000g离心10～20分钟，去除死细胞，得到上清液2和沉淀2；对上清液2进行离心，离心条件为4℃，10,000g，20～30分钟，得到上清液3和沉淀3，这一步是为了去除细胞碎片；接下来对上清液3进行离心，离心条件为4℃，100,000g，70～120分钟，得到上清液4和沉淀4，这一步是为了去除囊泡结构；之后对上清液4进行离心，离心条件为4℃，100,000g，70～120分钟，得到上清液5和沉淀5，沉淀5即为外泌体。接下来使用PBS重悬外泌体，即可得到外泌体悬液。该项技术耗时大约5～6个小时。

由于当前外泌体分离提取多为人工操作，整个分离提取过程繁琐，历经时间较长，现有自动分离提取设备产量低，耗时长，成本高，难以满足市场需求。各外泌体商家迫切需要一套能够快速、大量获取高纯度外泌体制备平台。例如超速离心法，过程繁琐，耗时耗力，对操作人员经验依懒性强，收集结果重复性差，回收率低，限制了其在外泌体工业化生产和临床应用；亲和层析、离子交换层析等层析法具备一定的工业纯化生产中，虽然可对目标纯化物进行定量、浓度检测等，但受制于层析柱的对进料样品的PH、缓冲和电导率以及纯化物自身的等电点等参数要求，在工业化进程中具有一定的局限性；免疫磁珠法和微流控法成本较高，经济性差，技术要求较高，适于微量纯化操作，难以大规模制备等问题。

此外，随着生物技术领域进展，为了生物药商业化生产，一些能够使用细胞培养基上清液等粗生物产品溶液来分离纯化得到目标产物的技术也逐步开始使用。例如基于亲和力的亲和层析方法。基于亲和力的层析以目标产物与固态基质以部分特异性相互作用为基础来分离生物分子。因此，目标产物与固态基质特异性结合，其他不能结合的非特异性组分从系统中流出。之后洗脱层析柱就能够收获目标产物。尽管亲和层析能够产生高度特异并能够产生非常纯的产物，但亲和层析所用的填料是其他材料的10多倍。并且维护、更换、工艺开发、检测也是一笔明显的支出成本。

此外传统的死端过滤技术，是将料液置于膜的上游，再压力差的推动下，水和小于膜孔的颗粒透过膜。大于膜孔的颗粒则被膜截留。死端过滤的缺陷是随着时间的增加，膜面上堆积的颗粒也在增加，过滤阻力增大，膜渗透速率下降。因此，死端过滤是间歇式的，必须周期性的停下来清洗膜表面的污染层，或者更换膜。而且只适用于通量比较小、固含量较低的液体过滤。切向流过滤适用于较大规模的料液过滤，液体流动在过滤截至表面产生剪切力，减小了滤饼层或凝胶层的堆积，保证了稳定的过滤速度。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种二次两级切向流分离纯化和浓缩外泌体的超滤装置，以解决目前传统方法分离纯化和浓缩外泌体时操作复杂、需要频繁维护以及成本高的问题。