[发明专利]特异性分子靶标及其检测金黄色葡萄球菌ST型的方法

说明书

本发明涉及微生物检验技术领域，尤其是具体公开金黄色葡萄球菌ST型特异性分子靶标及其检测金黄色葡萄球菌ST型的方法。本发明方法提供了用于鉴别3种金黄色葡萄球菌重要ST型的共6个新特异性分子检测靶标、PCR引物组以及荧光定量PCR、多重PCR快速检测方法。本发明的检测方法有能力一步鉴别金黄色葡萄球菌ST7、ST188、ST398，大大提高了金黄色葡萄球菌MLST分型效率，增强了实用性；本发明的检测方法还具有操作简单、结果判定易、检测时间短、特异性强、成本低的优点。

技术领域

本发明涉及微生物检验技术领域，尤其是涉及三种金黄色葡萄球菌ST型特异性分子靶标及其检测金黄色葡萄球菌ST型的方法。

背景技术

金黄色葡萄球菌是重要的食源性致病菌之一，也是常见的医院病原体之一。作为一种重要的人畜共患病原菌，金黄色葡萄球菌给人类健康、社会经济建设造成重大危害。研究表明，每年由金黄色葡萄球菌引发的食物中毒事件占食源性微生物食物中毒事件的25％，其产生的毒素可导致呕吐腹泻、化脓性感染、血流感染、上呼吸道感染，甚至威胁人类生命健康。随着抗生素广泛应用于细菌治疗，一系列耐药性(如耐甲氧西林、卡那霉素、氯霉素等)金黄色葡萄球菌也不断被发现，具有分布广泛、流行广泛、感染严重等特征，给临床治疗带来巨大的挑战。因此，建立精准的金黄色葡萄球菌溯源、流行性及危害分析平台具有重要意义。1988年Maiden等建立了多位点测序分型(multilocus sequence typing，MLST)技术，通过测定多个管家基因中长度约为470bp核心片段的核苷酸序列，分析不同的菌株之间序列型的差异，从而揭示菌株间等位基因的多样性，为全球流行病学数据标准化提供依据，广泛应用于细菌的流行病学、致病性和进化学等研究。据报道，金黄色葡萄球菌ST398多数表现多重耐药性，广泛分布于在畜牧养殖场、社区、医院等场所。研究人员对2010-2015年深圳地区临床分离金黄色葡萄球菌进行MLST分型发现，耐红霉素、四环素、妥布霉素的金黄色葡萄球菌主要型别为ST398、ST7、ST188及ST59等。根据本团队前期对全国重点城市的零售食品、巴氏乳中病原微生物污染调研发现，金黄色葡萄球菌ST7、ST188及ST398是重要ST型别。因此，快速准确鉴别上述3种金黄色葡萄球菌重要的ST型，可为金黄色葡萄球菌污染调查、临床监测、流行性及致病性研究提供依据。

根据SN/T 4525.2-2016《出口食品中致病菌的分子分型MLST方法第2部分：金黄色葡萄球菌》技术标准，金黄色葡萄球菌MLST分型方法主要包括：基因组DNA提取、多个管家基因选择及扩增、扩增产物纯化及测序分析、数据上传分析及分型等，整个过程操作繁琐、费时费力、成本也相对较高、不能满足大批量、快速鉴定的需求。另一方面，随着高通量测序技术的普及，通过获取金黄色葡萄球菌的全基因组数据，并将数据上传在线网站：https://pubmlst.org/databases/进行金黄色葡萄球菌MLST分型，该方法同样可对金黄色葡萄球菌进行ST分型，但依旧存在检测成本高、检测周期长等缺点。随着生物信息学及大数据库分析的发展，基于泛基因分析的组学技术广泛应用于细菌遗传变异、基因功能富集和进化分析等研究。因此，基于泛基因组分析技术挖掘金黄色葡萄球菌ST型分子鉴定靶标具有很大的潜力。

特异性分子检测靶标是保证PCR方法特异性、灵敏度的关键。目前，国内外PCR检测方法一步鉴定金黄色葡萄球菌ST7、ST188、ST398的分子检测靶标及引物相对较少，仅报道针对金黄色葡萄球菌ST398的分子靶标A07、C01和sau1-hsdS1，未有针对金黄色葡萄球菌ST7、ST188的分子检测靶标，难以满足实际快速检测的需要。而且，随着临床治疗过程中金黄色葡萄球菌新ST的不断发现，基于原有的分子靶标的精准鉴定面临了巨大的挑战。寻找新型特异性靶标分子用于3种金黄色葡萄球菌重要ST型(ST7、ST188、ST398)快速、精确检测具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供三种金黄色葡萄球菌ST型特异性分子靶标及其检测金黄色葡萄球菌ST型的方法。通过本发明的特异性分子靶标和引物组，能够精确的区分出金黄色葡萄球菌ST型，特异性较好，精确度较高。