[发明专利]抗菌肽defensin衍生物及其原核表达方法与应用

说明书

本发明公开了抗菌肽defensin衍生物及其原核表达方法与应用。本发明通过RACE PCR的方法从大麦虫扩增出抗菌肽defensin基因编码区，通过原核表达获得了具有良好抗菌活性的重组大麦虫defensin，实现了抗菌肽defensin体外表达。然后利用生物合成技术制备了大麦虫defensin衍生物，序列如SEQ ID NO:3～8所示。试验证实重组defensin及其衍生物ZM‑d14CFR对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均具有良好的抗菌活性，且无细胞毒性和溶血性，是理想的抗菌物质，应用前景广阔。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体地说，涉及抗菌肽defensin衍生物及其原核表达方法与应用。

背景技术

“超级细菌”的出现已成为目前全球公共卫生面临的巨大挑战。近年来，随着细菌耐药性问题日益严重，人们逐渐意识到“超级细菌”的感染可能会使人类面临无药可医的窘境。为维护公共卫生安全，自2001年以来，欧盟委员会针对其构成的相关威胁制定了“同一健康”方针。2006年，欧洲开始全面禁止在饲料中添加抗生素。我国自2020年起开的全面禁止在饲料中添加抗生素，以减少抗生素滥用造成的危害，维护动物源性食品安全和公共卫生安全，为此合理使用抗生素，研发新型抗生素替代药物势在必行。

抗菌肽是一类具有跟抗生素相同作用的多肽，具有相对分子质量低，抗菌高效和广谱，毒副作用小，免疫原性低，热稳定和水溶性良好，抗菌机理独特和不易产生耐药株等优点，在新型抗菌药物开发领域展现出巨大的潜力。

防御素是一类富含二硫键的阳离子型多肽，分布广泛，是生物免疫系统中的重要调节分子，也是生物自身防御体系的重要组成部分。研究表明防御素具有较强的抗菌、抗病毒功能，是一类重要的抗菌肽。目前，以防御素为主要来源的抗菌肽的开发与利用已成为药理学、昆虫学、微生物学等多个领域的研究热点。

由于天然防御素来源广泛，提取工艺复杂，产量低，大大限制了其作为抗生素替代物的发展。而防御素和其他蛋白质类物质一样，可由基因直接编码，因此采用基因工程技术开发和生产防御素类抗菌肽具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供抗菌肽defensin衍生物及其原核表达方法与应用。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种来自大麦虫的重组抗菌肽defensin(rZM-defensin)，所述抗菌肽包含如下的氨基酸序列或由其组成：

i)如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；或

ii)在i)的N端和/或C端连接标签得到的氨基酸序列。

第二方面，本发明提供抗菌肽defensin衍生物，其为ZM-d13、ZM-d14C、ZM-d14CF、ZM-d14CR或ZM-d14CFR：

ZM-d13：GGYCNSKSVCVCR-NH₂；

ZM-d14C：RGCYCNSKSVCVCR-NH₂；

ZM-d14CF：RGCYCNSKSFCVCR-NH₂；

ZM-d14CR：RGCRCNSKSVCVCR-NH₂；

ZM-d14CFR：RGCRCNSKSFCVCR-NH₂。

第三方面，本发明提供编码抗菌肽defensin或其衍生物的核酸分子。

第四方面，本发明提供含有所述核酸分子的生物材料，所述生物材料包括但不限于重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体、工程菌或转基因细胞系。

第五方面，本发明提供抗菌肽defensin或其衍生物的原核表达的方法，包括以下步骤：