[发明专利]一种近红外细胞染液的制取方法

说明书

本发明涉及一种近红外细胞染液的制取方法，在1‑乙基‑(3‑二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐（EDC）和N‑羟基琥珀酰亚胺（NHS）作用下，通过酰胺化反应将近红外光试剂吲哚箐绿（ICG）衍生物与含精氨酸‑甘氨酸‑天冬氨酸序列多肽(Arg‑Gly‑Asp，RGD)共价偶联，形成具有近红外光特性的新型细胞染液，在细胞染色时，细胞膜上表达的整合素能含RGD序列肽特异性结合，使得与含RGD序列肽偶联的ICG衍生物被细胞捕获，从而结合到细胞表面，在特定波长激发下，可作为发光探针、生物成像应用，具高分辨率、高灵敏特点。

技术领域

本发明涉及一种近红外细胞染液的制取方法。

技术背景

在生物实验中，为了能够清楚地观察到目标组织或细胞，通常会在细胞及组织环境中，加入某些发光试剂或其修饰物，使其穿透细胞膜或者与细胞膜表面特异性结合，这些发光试剂往往为荧光材料，通过一定激发使得试剂发光，从而达到细胞或组织染色目的。常用的荧光染液如DAPI等，大都由于激发及发光波长较短，因而细胞成像分辨率较低，不利于高灵敏生物实验的进行。而ICG及其衍生物不仅具有良好的近红外波长，而且其对细胞 毒性较低，使得其在新的细胞成像应用上具有很大应用前景。RGD肽是指一段包含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp)的多肽序列，其能被细胞表面表达的整合素特异性结合，因而含RGD序列肽的修饰物可增强其与细胞结合的黏附性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种近红外细胞染液的制取方法，

本发明再一目的在于提供所述方法制备的产品。

本发明的又的目的在于：提供所述产品的应用。

本发明提供一种近红外细胞染液的制取方法，用ICG衍生物与含RGD序列肽通过共价偶联，形成具有近红外光特性的新型细胞染液，包括下述步骤：

在含1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）的无菌水中加入红外光吲哚箐绿衍生物，避光摇晃活化后，再加入含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列多肽(Arg-Gly-Asp，RGD)，继续避光反应后, 使得活化后的ICG衍生物与含RGD 序列多肽进行酰胺化反应进行偶联，得到具有近红外光特性的细胞染液。

本发明涉及一种近红外细胞染液的制取方法，在 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）作用下，通过酰胺化反应将近红外光试剂吲哚箐绿（ICG）衍生物与含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列多肽(Arg-Gly-Asp，RGD) 共价偶联，形成具有近红外光特性的新型细胞染液。

进一步的，在含10 mL 含50 mmol EDC和25 mmol NHS的无菌水中加入1 mg红外光吲哚箐绿衍生物 ICG-COOH后，避光摇晃活化30 min，得到活化后的ICG-NHs，再加入100 μg/ mL RGDS (序列Arg-Gly-Asp-Ser)继续避光反应2 h, 使得活化后的ICG-NHs与RGDS进行酰胺化反应进行偶联，即可得到具有近红外光特性的新型细胞ICG-RGDS染液，4℃备用。

本发明还提供了根据上述制备的具有近红外光特性的新型细胞染液。

本发明也提供了根据上述具有近红外光特性的新型细胞染液产品的应用，用于细胞染色，作为发光探针、及在生物成像方面的应用。

在细胞染色时，细胞膜上表达的整合素能与含RGD序列肽特异性结合，使得与含RGD序列肽偶联的ICG衍生物被细胞捕获，从而结合到细胞表面，在特定波长激发下，可作为发光探针、生物成像应用，具高分辨率、高灵敏特点。

具体的，将配制成含1% ICG-RGDS染液的细胞培养基，加入生长期的人胃腺癌细胞MGC-803细胞中，培养箱中避光温育1 h，之后吸取培养基，用PBS冲洗贴壁的MGC-803细胞，去除非特异性吸附的染液，即可完成细胞染色。