[发明专利]一种稳定表达非洲猪瘟CD2v蛋白的CHO细胞系及其构建方法和应用在审
| 申请号： | 202111525599.7 | 申请日： | 2021-12-14 |
| 公开（公告）号： | CN114107176A | 公开（公告）日： | 2022-03-01 |
| 发明（设计）人： | 王晓虎;陈晶;王艳云;向华;黄元;黄忠;王刚 | 申请（专利权）人： | 广东省农业科学院动物卫生研究所 |
| 主分类号： | C12N5/071 | 分类号： | C12N5/071;C12N5/10;C12N15/34;C12N15/86;C12Q1/02;A61K39/12;A61P31/20;C12R1/91 |
| 代理公司： | 深圳市创富知识产权代理有限公司 44367 | 代理人： | 高冰 |
| 地址： | 510630 广*** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 稳定 表达 非洲 猪瘟 cd2v 蛋白 cho 细胞系 及其 构建 方法 应用 | ||
1.一种稳定表达非洲猪瘟CD2v蛋白的CHO细胞系，其特征在于，所述细胞系为中国仓鼠卵巢细胞CHO-CD2v，于2021年11月11日送往广东省微生物菌种保藏中心保藏，保藏编号为GDMCC No:62052。
2.权利要求1所述的稳定表达非洲猪瘟CD2v蛋白的CHO细胞系的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将目的基因CD2v连接至DC-SH02载体上，构建得到DC-SH02-CD2v重组质粒；
S2、将重组质粒DC-SH02-CD2v和pROSA26-Cas9 gRNA质粒共转染至中国仓鼠卵巢细胞CHO中；
S3、对转染后的细胞利用嘌呤霉素筛选方法和有限稀释法筛选得到稳定表达CD2v的细胞系。
3.根据权利要求2所述的稳定表达非洲猪瘟CD2v蛋白的CHO细胞系的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述目的基因是以pMD18-CD2v质粒为模板，用引物CD2v-F和CD2v-R扩增得到，所述CD2v-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述CD2v-R的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。
4.根据权利要求2所述的稳定表达非洲猪瘟CD2v蛋白的CHO细胞系的制备方法，其特征在于，步骤S2中，是通过重组质粒DC-SH02-CD2v将目的基因CD2v导入到中国仓鼠基因组的安全位点。
5.根据权利要求4所述的稳定表达非洲猪瘟CD2v蛋白的CHO细胞系的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述安全位点为ROSA26安全位点。
6.根据权利要求2述的稳定表达非洲猪瘟CD2v蛋白的CHO细胞系的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述DC-SH02载体包含有CMV启动子序列和ROSA26安全位点重组臂。
7.根据权利要求6所述的稳定表达非洲猪瘟CD2v蛋白的CHO细胞系的制备方法，其特征在于，所述DC-SH02载体还包含有PolyA信号序列和嘌呤霉素耐性基因序列。
8.根据权利要求2述的稳定表达非洲猪瘟CD2v蛋白的CHO细胞系的制备方法，其特征在于，步骤S3中，嘌呤霉素筛选为利用含有嘌呤霉素的培养基对转染后的细胞进行培养，挑出单个细胞集落，所述嘌呤霉素在培养基中的浓度为7μg/mL。
9.权利要求1所述的稳定表达非洲猪瘟CD2v蛋白的CHO细胞系在制备CD2v蛋白中的应用。
10.权利要求1所述的稳定表达非洲猪瘟CD2v蛋白的CHO细胞系在非洲猪瘟的药效筛选和/或疫苗生产中的应用。
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