[发明专利]一种表达HOXA10的人脐带间充质干细胞系及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种表达HOXA10的人脐带间充质干细胞系，HOXA10的序列如SEQ ID NO：4所示。

2.权利要求1所述的一种表达HOXA10的人脐带间充质干细胞系的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）从人脐带间充质干细胞中扩增HOXA10基因；

（2）将步骤1）获得的HOXA10基因克隆到慢病毒载体中；

（3）将带有HOXA10的慢病毒感染人脐带间充质干细胞，得到表达HOXA10的人脐带间充质干细胞系。

3.根据权利要求2所述的一种表达HOXA10的人脐带间充质干细胞系的制备方法，其特征在于：在步骤1）中，先提取人脐带间充质干细胞的总RNA，然后反转录为cDNA，根据HOXA10的CDS序列，HOXA10的CDS序列如SEQ ID NO：1所示，利用primer5软件设计与pLv-AcGFP载体HindIII酶切位点前后20bp同源臂的引物序列，以人脐带间充质干细胞反转录获得的cDNA为模板进行扩增。

4.根据权利要求3所述的一种表达HOXA10的人脐带间充质干细胞系的制备方法，其特征在于：所述的引物序列的上游引物的序列如SEQ ID NO：2所示，下游引物的序列如SEQ IDNO：3所示。

5.根据权利要求2所述的一种表达HOXA10的人脐带间充质干细胞系的制备方法，其特征在于：在步骤2）中，将HOXA10基因克隆到慢病毒载体pLV-AcGFP1-N1质粒中，用限制性内切酶HindIII对载体pLV-AcGFP进行酶切，对以上酶切产物和PCR产物进行回收，然后将酶切产物和PCR产物进行同源重组。

6.根据权利要求2所述的一种表达HOXA10的人脐带间充质干细胞系的制备方法，其特征在于：在步骤3）中，先进行慢病毒的包装，然后将人脐带间充质干细胞培养液重悬慢病毒沉淀，吹打混匀后分装于离心管中，置于-80℃冰箱内保存。

7.根据权利要求6所述的一种表达HOXA10的人脐带间充质干细胞系的制备方法，其特征在于：所述的慢病毒包装的过程包括如下步骤：

1）选取生长状态良好且处于指数生长期的P8代HEK-293T细胞，接种于细胞培养皿中，于37℃，气体浓度百分比为5%的CO₂的细胞培养箱中培养；

2）待细胞密度汇合至60-70%时，至少提前1h将细胞培养液换成无抗生素培养液继续培养；

3）准备离心管，加入500 μl 的Opti-MEM,加入Lipofectamin 2000,上下颠倒数次混匀后室温静置5min；

4）另取干净离心管加入500μl Opti-MEM,混入目的质粒HOXA10-pLV-AcGFP、 psPAPX2和pMD2.G, HOXA10-pLV-AcGFP、psPAPX2和pMD2.G的质量比为8:6:3,上下颠倒混匀；

5）将含DNA的Opti-MEM加入到含Lipofectamin 2000的管中，弹指混匀，室温静置15min,使DNA与Lipofectamin2000均匀混合；

6）将混合物以十字交叉方式缓慢加到HEK-293T细胞中，摇晃培养皿混匀后置于37℃，气体浓度百分比为5%CO₂细胞培养箱中过夜培养；

7）10-12h后，弃上清，更换新鲜培养液，继续培养48h后收集上清，并继续更换新鲜培养液，72h后再次收集上清；

8）0.45um的滤器过滤收集所得的上清，除去细胞碎片；加入体积百分比浓度为40%的PEG8000至终体积百分比浓度为10%,浓缩所得病毒；

9）将含体积百分比浓度为10% PEG8000的病毒上清置于4℃摩天轮转轮中旋转8-10h；

10）取出浓缩上清，4℃，4000rpm离心40min以上后弃去上清，完成慢病毒的包装。

8.权利要求1所述的表达HOXA10的人脐带间充质干细胞系在制备用于治疗子宫内膜损伤的药物中的应用。