[发明专利]一种循环肿瘤细胞系的建立方法

说明书

本发明公开了一种循环肿瘤细胞系的建立方法，该方法包括：在无菌细胞培养容器a中平面培养肿瘤细胞；每2～3天更换一次无菌细胞培养容器a中的贴壁细胞培养基；每次更换培养基时，将至少一个无菌细胞培养容器a中旧的培养基加入到一个无菌细胞培养容器b中；将无菌培养容器b静置使悬浮细胞沉降富集；吸走上层培养基后向无菌培养容器b中加入悬浮细胞培养基；震荡无菌培养容器b使细胞分散均匀；再利用悬浮培养方法继续扩增无菌培养容器b中的悬浮细胞，使其达到一定数量得到对应的循环肿瘤细胞系。本发明能够快速、简便地建立贴壁生长的肿瘤细胞系相对应的循环肿瘤细胞系，获得数量巨大，且便于保存、扩增的循环肿瘤细胞。

技术领域

本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种循环肿瘤细胞系的建立方法。

背景技术

恶性肿瘤是人类健康的主要威胁之一。绝大多数肿瘤相关的死亡是由肿瘤的复发和转移导致的。然而肿瘤转移的机制尚不完全清楚。揭示肿瘤复发和转移的机制，对开发新的诊断和治疗方法至关重要。实体肿瘤会持续脱落肿瘤细胞，部分脱落的细胞能进入血液循环系统，被称为循环肿瘤细胞。循环肿瘤细胞是恶性肿瘤经血液转移的关键媒介。如果能确定循环肿瘤细胞的特异性标记和生物学特性，则有望建立新的肿瘤转移风险诊断方法，甚至开发特异性药物降低肿瘤转移的发生几率。

然而，由于循环肿瘤细胞数量非常少。绝大多数肿瘤患者每10mL外周血中的循环肿瘤细胞数量少于10个。而同样体积的外周血却包含了数千万的血液细胞，给循环肿瘤细胞的提取和研究带来了较大的困难。另一方面，由于循环肿瘤细胞与其原位的实体瘤细胞功能和表型不尽相同。循环肿瘤细胞发生了包括上皮-间质转变在内的一系列变化，使其能适应无锚定生长和血液流动形成的剪切力。不仅如此，研究表明循环肿瘤细胞的表型存在异质性和动态变化，因此难以建立明确的、标准化的循环肿瘤细胞特异性标记。这给研究循环肿瘤细胞带来了更大的困难。

另一方面，科学工作者们通过提取实体肿瘤细胞体外培养的方式，已经建立了海量的永生化实体肿瘤细胞系。如果能基于这些细胞系，建立循环肿瘤细胞系，将对推动肿瘤转移和治疗的研究起到巨大的帮助。但相关研究尚未见报导。

发明内容

为了解决目前难以建立明确的、标准化的循环肿瘤细胞系特异性标记的问题；本发明提供了一种循环肿瘤细胞系的建立方法。

为了达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

本发明提供了一种循环肿瘤细胞系的建立方法，该方法包括如下步骤：

S1、对肿瘤细胞进行贴壁细胞培养，包括：

S11、在无菌细胞培养容器a中采用平面培养的方法对肿瘤细胞进行贴壁细胞培养，平面培养时的培养基使用该肿瘤细胞推荐的贴壁细胞培养基或通用培养基；每2～3天更换一次无菌细胞培养容器a中的培养基，贴壁细胞达到80％～90％融合度时传代；

S12、每次更换培养基时，将至少一个无菌细胞培养容器a中旧的培养基加入到一个无菌细胞培养容器b中，此时旧的培养基中包含贴壁细胞系对应的少量悬浮细胞；

S2、对悬浮细胞进行悬浮细胞培养，包括：

S21、将无菌培养容器b静置使悬浮细胞沉降富集；然后，吸走上层培养基；

S22、向无菌培养容器b中加入适合悬浮细胞的悬浮细胞培养基，使无菌培养容器b中的培养基体积恢复到初始体积；

S23、震荡无菌培养容器b使细胞分散均匀，此时无菌培养容器b中含有的悬浮细胞即为贴壁肿瘤细胞系对应的循环肿瘤细胞；

S3、利用悬浮培养方法，扩增无菌培养容器b中的循环肿瘤细胞，即可建立对应的循环肿瘤细胞系。

进一步的，还包括：S24、重复S21和S22以提高所述无菌培养容器b中悬浮培养基的比例。