[发明专利]NOX2基因缺陷rd1小鼠模型及其制备方法和应用

说明书

本发明涉及NOX2基因缺陷rd1小鼠模型及其制备方法和应用，属于生物技术领域。本发明提供了一种制备NOX2基因缺陷rd1小鼠模型的方法，所述方法通过将NOX2基因敲除小鼠和rd1小鼠经杂交和筛选，得到了NOX2基因缺陷rd1小鼠模型；使用所述方法制得的NOX2基因缺陷rd1小鼠模型视网膜外核层感光细胞丢失明显延迟，小胶质细胞活化显著抑制，小胶质细胞中NOX2表达明显减少，这不仅进一步验证了小胶质细胞中NOX2活化是遗传性视网膜变性的致病机制，而且为筛选和研发作用机制更明确、特异性更强、更有上市和临床应用前景的治疗和/或预防视网膜变性的药物提供了基础，极具应用前景。

技术领域

本发明涉及NOX2基因缺陷rd1小鼠模型及其制备方法和应用，属于生物技术领域。

背景技术

原发性视网膜色素变性(retinitis pigmentosa,RP)是引起进行性感光细胞凋亡的一组遗传性眼病，发病率为1/3000～4000，已导致包括全球超过150万成年者致盲。虽然基因及干细胞疗法在治疗原发性视网膜色素变性上取得了一定的进展，但由于RP表型的复杂性或技术本身存在的潜在问题，其在临床上广泛应用还不现实，因此，对继发于基因变异下游共同病理机制的研究仍十分重要。即使不能根本改变病变的致病原因(基因突变)，但以其共同致病机制核心环节为靶点进行药物治疗仍可延缓感光细胞丢失，推迟患者致盲时间，提高其生活质量。

大量研究成果表明，慢性神经元炎症可导致多种中枢神经系统(central nervoussystem,CNS)变性疾病的发展。小胶质细胞是CNS中天然的宿主细胞，活化后可产生多种神经元毒性因子诱导细胞死亡。视网膜是延伸的脑组织。RP局部的炎症反应曾被认为是基因变异导致感光细胞死亡的继发事件。然而，越来越多的证据显示，慢性炎症反应可能导致杆锥细胞变性，RP病人视网膜炎症水平与其视功能负相关。在RP实验动物模型中，以往的研究显示，小胶质细胞在感光细胞调亡发生之前即外移至视网膜外核层中，活化并释放大量神经元毒性因子TNF-α。抑制小胶质细胞活化可减轻感光细胞丢失。可见，小胶质细胞不只是感光细胞凋亡的旁观者，而是更显著地参与了视网膜变性的启动及持续过程，是导致感光细胞最终凋亡的重要致病途径。现阶段，RP中小胶质细胞活化的机制还不十分清楚。

CNS近期的研究结果显示，NADPH氧化酶(nicotinamide adeninedinucleotidephosphate oxidases；NOXs)活化是激活小胶质细胞的重要机制。尽管多种病理因素通过小胶质细胞活化发挥毒性作用，但产生细胞内外活性氧(reactive oxidativespecies,ROS)是大多数神经元变性疾病共同的结局及特征。通常在巨噬细胞系统中ROS主要有三种来源：细胞内过氧化物酶、细胞膜表面NOXs或线粒体的氧化过程。其中，NOX2是小胶质细胞受刺激后产生细胞外ROS的主要来源。在NOX的7种异构体(包括NOX1-5、DUOX1以及DUOX2)中，NOX2主要存在于小胶质细胞及巨噬细胞中。NOX2是将氧气分解成O^2-的膜绑定酶。该酶复合体在静止的吞噬细胞中处于休眠状态，受到刺激后活化。在静止的吞噬细胞中，NOX2的细胞浆亚单位(P47^phox、P67^phox、P40^phox及Rac2)活化时向细胞膜移位，与细胞膜中的亚单位(gp91^phox、P22^phox)结合，表现为可产生O^2-的活化酶的状态。小胶质细胞中NOX2活化通过两种途径对神经元细胞产生毒性作用。一方面，通过产生细胞外ROS直接产生神经元毒性；另一方面，启动细胞内ROS信号通路(redox signaling)。细胞内ROS可作为第二信使调节多种下游信号分子，包括丝裂原激活蛋白激酶(mitogen-acivated protein kinase,MAPK)、NF-κB等，从而促进大量致炎或神经元毒性因子产生,包括TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS等。而ROS激活凋亡前期信号通路MAPK，如SAPK/JNK、ERK1/2和p38MARK，P53可直接诱导细胞凋亡。