[发明专利]一种用于检测西伯利亚鲟线粒体基因的引物探针组合物、试剂盒及其应用

说明书

本发明公开了一种用于检测西伯利亚鲟线粒体基因的引物探针组合物、试剂盒及其应用。本发明首先公开了用于检测西伯利亚鲟线粒体基因D‑LOOP的引物探针组合物，序列如SEQ ID NO.1～3所示。本发明还公开基于所述引物探针组合物建立的检测西伯利亚鲟线粒体基因D‑LOOP的方法。本发明以西伯利亚鲟线粒体基因D‑LOOP部分基因作为靶区域设计引物和TaqMan‑MGB探针，建立并优化得到可检测西伯利亚鲟线粒体基因的方法，该方法快速、灵敏和特异，可用于纯种鲟鱼的鉴定，具有较为广阔的应用前景。

技术领域

本发明属于鲟鱼种质鉴定及鲟鱼源性成分检测领域，特别涉及一种用于检测西伯利亚鲟线粒体基因的引物探针组合物、试剂盒及其应用。

背景技术

我国鲟鱼商业养殖从二十世纪九十年代起兴，先后突破了西伯利亚鲟、匙吻鲟、小体鲟、史氏鲟、俄罗斯鲟、大杂交(达氏鳇♀×史氏鲟♂)、鳇、中华鲟、长江鲟等近10种主要鲟鱼的全人工繁殖技术，鲟鱼养殖与鲟鱼子酱加工已经发展成产业，成为世界鲟鱼养殖产量第一国和鲟鱼子酱加工出口大国。伴随着鲟鱼养殖产业的迅猛发展，许多鲟鱼养殖场不明亲鱼种质，随意杂交，导致鲟种质资源混杂，生产苗种质量和数量均有所下降，制约鲟产业的整体发展。如何保护鲟鱼野生种群、同时合理守法的进行鲟鱼养殖和遗传育种、健康发展鲟鱼产业，是当前研究的重点。

因而，鲟鱼品种的鉴定非常重要，一方面可以保护濒危野生鲟鱼物种；此外，通过鉴定亲本可以明确鲟鱼的品系，用于指导鲟鱼的杂交育种、养殖和生产；同时对商品鱼进行品种鉴定，可在国内流通环节提供检测鉴定证明，更好的监督、规范鲟鱼养殖产业的健康发展。建立西伯利亚鲟鉴定方法，为鲟形目的物种鉴定摸索经验、奠定工作基础，可在进出口贸易和国内鲟鱼养殖交易市场率先应用，指导实际工作，保护和促进国内鲟鱼产业的健康可持续发展。

目前，物种鉴定方法研究比较多的是针对线粒体基因细胞色素B(Cytb)、细胞色素氧化酶亚单位I(COI)、DNA控制区(D-LOOP)等建立的特异性PCR方法。微卫星标记是进行种群遗传学研究中常用的分子标记，具有共显性、分辨率、重复率及可信度高的优点，是水产研究中使用最为广泛的核基因组标记。鲟的种质鉴定可分别从线粒体基因组和核基因组两个层面展开，是全面准确的检测杂交鲟父母本来源的有效方式。但由于鲟形目鲟鱼种类繁多，且不同品种的鲟鱼基因序列同源性很高，目前国内外发表的文献，通常是使用十几对微卫星引物并结合软件分析，对不同种属的鲟鱼进行鉴定。这些方法引物复杂、操作繁琐、花费时间长，还需要专业的分子生物学软件，对检测人员的专业程度要求较高，不适用于口岸基层实验室，不能满足海关口岸快速通关的要求。

TaqMan荧光定量PCR检测技术与常规PCR技术相比，具有很多突出的优点，不仅检测速度快(仅需2h)，结果可靠，而且不需要开盖分析产物，从而减少气溶胶污染的机会。因此，基于TaqMan荧光定量PCR检测技术对西伯利亚鲟线粒体基因进行检测鉴定，可用于纯种鲟鱼的种质鉴定，具有广阔的应用前景。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种用于检测西伯利亚鲟线粒体基因的引物探针组合物、试剂盒及其应用。该引物对特异性强、灵敏度高，MGB探针相比传统普通TaqMan探针缩短了探针长度，提高了qPCR的信噪比和分辨率。本发明主要是通过以下技术方案解决上述技术问题。

一方面，本发明提供了一种用于检测西伯利亚鲟线粒体基因D-LOOP的引物探针组合物，所述引物探针组合物包括SEQ ID NO.1所示的单链DNA分子和SEQ ID NO.2所示的单链DNA分子组成的引物对，以及SEQ ID No.3所示的TaqMan-MGB探针。

优选的，所述TaqMan-MGB探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有MGB无荧光淬灭基团。

另一方面，本发明还提供了一种用于检测西伯利亚鲟线粒体D-LOOP基因的引物探针组合物在检测西伯利亚鲟线粒体基因中的应用。