[发明专利]非对称环介导恒温条件下合成核酸的方法及试剂盒和应用

权利要求书

1.非诊断目的的恒温条件下合成核酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）提供一种核酸，该核酸3’至5’方向依次由Rc、Fc、R、Dc、D区组成，所述核酸的5’端的D区与相邻的Dc退火，3’端的Rc区与同一链上的R区的退火，可组成非对称环结构；

2）步骤1）提供的所述核酸的3’端的Rc区与R区退火，以该核酸为模板合成其自身的互补链，将合成完后的核酸序列称为核酸A；

3）使第一寡核苷酸与步骤1）提供的所述核酸的Fc区退火，其中所述第一寡核苷酸包括R区与F区；然后以所述第一寡核苷酸的F区作为合成起点，进行合成步骤；所述R区与Rc区互补，所述F区与Fc区互补；

4）所述核酸A的3’端的Dc区与临近的D区退火，以核酸A为模板合成其自身的互补链，并引发自动的核酸链延伸反应。

2.根据权利要求1所述的恒温条件下合成核酸的方法，其特征在于：所述合成核酸的方法中通过引入加速引物BP，该引物是位于F区到Rc区的中间区段。

3.一种核酸，其特征在于：核酸3’至5’方向依次由Rc、Fc、R、Dc、D区组成；所述核酸的5’端的D区与相邻的Dc退火，3’端的Rc区与同一链上的R区的退火，可组成非对称环结构。

4.权利要求3所述的核酸的合成方法，包括以下步骤：

1-a）退火步骤，使第一寡核苷酸与模板的Fc区退火，其中所述模板3’至5’方向依次由Fc区和R区组成，所述第一寡核苷酸包括R区与F区，所述R区与F区的5’侧相连，其中，

F区：具有与Fc区互补的核苷酸序列的区，

R区：具有与Rc区互补的核苷酸序列的区；

1-b）以所述第一寡核苷酸的F区作为合成起点，合成第一核酸；所述第一核酸具有与所述模板互补的核苷酸序列，所述第一核酸的5’末端具有可与同一条链上的Rc区退火的R区；

1-c）在恒温条件下，使第二寡核苷酸与所述第一核酸的Rc区退火，其中所述第二寡核苷酸从3’端到5’端依次为R区、Dc区、D区；其中，

R区：具有与Rc区互补的核苷酸序列的区，

Dc与D区：Dc与D区是相互互补的核苷酸序列的区；

1-d）以所述第二寡核苷酸的R区作为合成起点，合成第二核酸，即获得目标核酸片段。

5.根据权利要求4所述的核酸的合成方法，其特征在于：步骤1-a）所述模板为RNA，步骤1-b）中的第一核酸通过具有反转录酶活性的酶来合成。

6.根据权利要求4或5所述的核酸的合成方法，其特征在于：所述F区、和R区的核酸片段均为10-60bp，所使用D区为任意序列，大小为5-30bp。

7.一种合成核酸的试剂盒，所述试剂盒包括以下组分：

第一寡核苷酸，其包括F区和R区，所述R区与F区的5’侧相连，其中，

F区：具有与Fc区互补的核苷酸序列的区，

R区：具有与Rc区互补的核苷酸序列的区；

第二寡核苷酸，其包括R区和D、Dc区，其中D区与Dc区的5’侧相连，Dc区与R区的5’侧相连，其中，

R区：具有与Rc区互补的核苷酸序列的区，

Dc与D区：Dc与D区相互互补的核苷酸序列的区，其序列为任意；

核酸合成催化酶；

核苷酸，其作为DNA聚合酶的底物。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括加速引物BP，该引物位于原始核酸F区到Rc区的中间区段。

9.权利要求7-8任一项所述试剂盒在合成核酸或检测样品中靶核苷酸序列中非诊断目的的应用。