[发明专利]非对称环介导恒温条件下合成核酸的方法及试剂盒和应用

说明书

本发明公开了非诊断目的非对称环介导恒温条件下合成核酸的方法及试剂盒和应用。所述方法为：提供一种核酸的步骤，该核酸3’至5’方向依次由Rc、Fc、R、Dc、D区组成，所述核酸的5’端的D区与相邻的Dc退火，3’端的Rc区与同一链上的R区退火，可组成非对称环结构；所述核酸3’端的Rc区与R区退火，以该核酸为模板合成其自身的互补链，将合成的核酸序列称为核酸A；使用引物第一寡核苷酸与所述核酸的Fc区退火，进行合成步骤；所述核酸A的3’端的Dc区与临近的D区退火以核酸自身为模板进行反应使核酸链不断延伸。利用本发明的核酸合成方法，目标片段可仅为40bp左右，较其他恒温扩增方法而言可以容易的实现恒温条件下的核酸扩增。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体地，本发明涉及一种非诊断目的的恒温条件下合成核酸的方法及试剂盒。

背景技术

聚合酶链反应(PCR)方法被认为是扩增靶基因的方法最经典方法(Saiki，Gelfandet al.1988)，亦是体外核酸序列扩增应用最为普遍的技术。然而PCR方法的主要问题是：实际操作中必须要用专门的程序温度控制系统，这使得应用成本极大提高。

LAMP技术(Notomi，Okayama et al.2000)是可以对靶基因进行恒温条件下的扩增，其核心是利用针对靶基因上的六个区域设计四条特异性引物依靠一种高活性链置换DNA聚合酶，使得链置换DNA合成在不停地自我循环。该技术的其中一个局限是，因该方法高特异性和灵敏度等特点依赖于4条引物的性质，最佳引物的获得通常需要进行序列比对、在线引物设计、引物筛选及特异性试验，这一过程十分繁琐。

发明内容

本发明的目的是提供一种单酶及恒温条件下完成核酸合成的方法，本发明方案是受到DNA常见双螺旋结构、分子信标探针及LAMP启发，提出的以PCR引物为基础重新设计引物的新工作模式，形成非对称环起始扩增结构，设计并优化该结构环的形成过程，并且具有可选加速引物的特点。本发明的一个优势是，较LAMP目标片段最小为120bp，本方法可仅为40bp左右，可较容易的实现核酸恒温扩增的扩增。本发明利用聚合酶催化链置换型的互补链合成而不需复杂的温度控制，有益于核酸的合成。该DNA聚合酶是LAMP等核酸恒温扩增方法中用到的酶。

本发明改进了已知方法3’-OH的供给，结果发现通过利用具有特定结构的寡核苷酸，不需任何额外酶反应3’-OH结构就可被提供，由此得出本发明。即本发明涉及合成核酸的方法，通过用所述核酸合成方法扩增核酸的方法和应用所述方法合成核酸的试剂盒。

本发明的具体技术方案如下：

一种非诊断目的非对称环介导的恒温条件下合成核酸的方法，包括以下步骤：

1)提供一种核酸的步骤，该核酸3’至5’方向依次由Rc、Fc、R、Dc、D区组成，所述核酸的5’端的D区与相邻的Dc退火，3’端的Rc区与同一链上的R区的退火，可组成非对称环结构；

2)步骤1)提供的所述核酸的3’端的Rc区与R区退火，以该核酸为模板合成其自身的互补链，将合成完后的核酸序列称为核酸A；

3)使第一寡核苷酸与步骤1)提供的所述核酸的Fc区退火，然后以所述第一寡核苷酸的F区作为合成起点，进行合成步骤；其中所述第一寡核苷酸包括R区与F区；

4)所述核酸A的3’端的Dc区与临近的D区退火，以核酸A为模板合成其自身的互补链，并引发自动的核酸链延伸反应。

参见图1，为本发明中上述合成核酸所对应的合成步骤图解。本发明中的所述恒温是指整个反应过程在60-65℃的温度范围内进行合成。