[发明专利]一种植物的质膜荧光标记方法及质膜蛋白的定位和动态监测方法

说明书

本发明提供了一种植物的质膜荧光标记方法及质膜蛋白的定位和动态监测方法，属于质膜染色技术领域。本发明采用FM4‑64染料对质膜结构进行染色，所述FM4‑64染料能够嵌合在质膜双分子层中，并跟随质膜进行动态转运，因此也可以进行质膜内吞和转运等后续的相关研究所使用。而且本发明所述荧光标记方法，可在遗传转化或瞬时转化就能进行质膜的荧光标记，节省了实验时间，并且不存在荧光信号的干扰问题。

技术领域

本发明属于质膜染色技术领域，具体涉及一种植物的质膜荧光标记方法及质膜蛋白的定位和动态监测方法。

背景技术

细胞膜是细胞包围内容物的一层界膜。可以保护细胞内微环境的相对稳定，阻止外来物质的随意进入，同时可以感受外界环境的改变。细胞膜首先是一个具有主动运输功能和高度选择性的膜结构，保持着细胞内外的物质浓度差异，控制着营养成分向细胞内的转运以及细胞内代谢废物、分泌物的排出。其次它具有感受细胞外界信号并进行信号传递的功能，介导了细胞外因子对细胞引发的各种生理、生化反应。它还是细胞与相邻细胞和细胞外基质的连接中介。因此，质膜的研究是当今生物学和生物技术领域中的重要内容，在基础和应用研究中都具有重要的意义。

荧光成像技术具有灵敏度高和生物相容性好等优点，所以被广泛应用于生物质膜成像领域。传统的植物质膜荧光标记方法是利用报导的质膜定位蛋白与荧光蛋白融合，转化到植物中后再进行荧光观察，具有操作复杂，难度大，周期长等缺点，因此在很多实验中的应用受到了限制。而如何提供一种操作简单、快速的质膜荧光标记方法，是本领域所急需和必要的。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种植物的质膜荧光标记方法及质膜蛋白的定位和动态监测方法，可以有效、准确、快速地研究植物的质膜蛋白的定位和动态。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种植物的质膜荧光标记方法，包括以下步骤：利用FM4-64染料对分离得到的质膜结构进行染色，采用缓冲液对已染色的质膜结构进行清洗，得质膜荧光标记的质膜结构。

优选的，所述FM4-64染料的工作液浓度为4μM。

优选的，所述植物的质膜结构包括根毛细胞和/或叶肉原生质体。

优选的，所述植物包括拟南芥。

优选的，所述拟南芥的根毛细胞的分离方法，包括：将拟南芥种子消毒后播种于固体1/2MS培养基上，4℃放置2d，而后进行7d光暗交替培养，切取拟南芥幼苗的根作为染色材料；

所述拟南芥的叶肉原生质体的分离方法，包括：切取拟南芥第3～4轮叶片，去除叶片下表皮后进行酶解，将酶解后的叶片置于W5溶液中，收集沉淀，即为分离的叶肉原生质体。

优选的，所述光暗交替培养的培养温度为22℃，光周期为12h光照/12h黑暗，光强度为150μE m^-2s^-1；

所述酶解用的酶解液包括以下质量体积百分含量的原料：1.5％纤维素酶R10，0.25％果胶酶R10，0.05％β-巯基乙醇和1％BSA，还包括以下物质的量浓度的原料：0.4M甘露醇，20mM KCl，20mM MES和10mM CaCl₂，pH＝5.7。

优选的，所述染色的温度为20～25℃，染色时间为1min。

优选的，对所述植物的质膜结构染色后，还包括利用ddH₂O对已染色的根毛细胞进行清洗，利用W5溶液对已染色的叶肉原生质体进行清洗。

本发明还提供了一种监测植物的质膜蛋白的定位和动态的方法，包括以下步骤：采用激光共聚焦显微镜，对利用上述质膜荧光标记方法得到的质膜荧光标记的质膜结构进行观察和拍照。

优选的，设置荧光激发波长为515nm，发射波长为640nm。