[发明专利]一种携带狂犬病毒基因的重组流感病毒株及其制备方法与应用

说明书

本发明提供了一种携带狂犬病毒基因的重组流感病毒株及其制备方法与应用，所述重组流感病毒株为携带狂犬病毒基因的流感病毒载体通过反向遗传系统在细胞中拯救出的携带狂犬病毒基因的重组流感病毒；所述狂犬病毒基因位于甲型流感病毒NA片段的开放阅读框内：所述狂犬病毒基因片段的5’端通过自剪接多肽与甲型流感病毒NA片段3端’连接；所述狂犬病毒基因片段的3’端连接包装信号，所述包装信号的序列为NA开放阅读框3’端157bp的同义序列；所述自剪接多肽为T2A或P2A。该重组流感病毒可在宿主细胞或鸡胚中稳定传代，可用于狂犬病毒疫苗的开发、药物的开发以及利用细胞或鸡胚作为生物反应器生产狂犬病毒蛋白。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种携带狂犬病毒基因的重组流感病毒株及其制备方法与应用。

背景技术

A型流感病毒(influenza A virus),属于正粘病毒科，其基因组由8个负极性RNA片段(vRNA)组成。在流感病毒中其基因组的8个RNA片段与三种聚合酶蛋白(PB2、PB1、PA)以及核蛋白(NP)结合形成了具有活性的核糖核蛋白聚合体(RNPs)。A型流感病毒感染宿主细胞时，血细胞凝集素(HA)介导病毒颗粒与宿主细胞上唾液酸受体结合。在流感病毒以膜融合的方式进入细胞后，病毒会释放出RNPs，RNPs进入细胞核后开始病毒基因组的复制与转录，8种RNA片段分别转录出信使RNA(mRNA)和互补RNA(cRNA)，mRNA经翻译合成病毒蛋白，cRNA通过复制产生vRNA，之后经过组装产生子代流感病毒。甲型流感病毒的基因组包含8个片段。其中病毒片段聚合酶(PB2)、血细胞凝集素(HA)、核蛋白(NP)、神经氨酸酶(NA)的mRNA是单顺反子。很多研究发现聚合酶PB1包含多个翻译起始位点。聚合酶(PA)则可以通过核糖体移框和多个翻译起始位点编码多种蛋白。基质蛋白(M)和非结构蛋白(NS)则会发生RNA的剪接产生多种mRNA。通过将M和NS中的RNA剪接位点突变并将其开放阅读框通过连接肽连接也可以表达相应的蛋白，拯救出的重组流感病毒在适宜条件下可以正常的复制。

狂犬病(rabies)又称恐水病(hydrophobia)，是一种典型的人畜共患性传染病。狂犬病一般潜伏几天至几个月，病毒首先感染外周神经，通过脊髓索感染脑部中枢神经，从而引发致命性的脑炎和脊髓炎，被感染人或动物就会面临死亡。一旦发病，病死率几乎达100％。早在1885年法国科学家路易斯·巴斯德就首次发明了狂犬病疫苗,并成功应用到人狂犬病的防控。时至今日,狂犬病疫苗的发展历经组织灭活苗、禽培苗、细胞苗、基因工程苗等不同的发展阶段。然而现有的狂犬病疫苗通常是肌肉注射、皮下注射等方式；

因此，有必要开发一种携带狂犬病毒基因的重组流感病毒株。

发明内容

为了解决所述技术问题，本发明提供了一种携带狂犬病毒基因的重组流感病毒株及其制备方法与应用，本发明首次以流感病毒为载体携带狂犬病毒基因，表达狂犬病毒蛋白的重组流感病毒可以同时作为狂犬病毒和流感病毒疫苗使用，具有两种疫苗的功效。作为疫苗时可采用喷鼻免疫是简单有效适合广大人群使用的免疫方式。相比于目前的治疗狂犬病毒的手段，利用重组流感病毒进行免疫方法更为便捷。

在本发明的第一方面，提供了一种携带狂犬病毒基因的重组流感病毒株，

所述重组流感病毒株为携带狂犬病毒基因的流感病毒载体通过反向遗传系统在细胞中拯救出的携带狂犬病毒基因的重组流感病毒；

所述狂犬病毒基因位于甲型流感病毒NA片段的开放阅读框内：所述狂犬病毒基因片段的5’端通过自剪接多肽与甲型流感病毒NA片段3端’连接；所述狂犬病毒基因片段的3’端连接包装信号，所述包装信号的序列为NA开放阅读框3’端157bp的同义序列；所述自剪接多肽为T2A或P2A。

进一步地，所述狂犬病毒基因片段包括狂犬病毒糖蛋白的全基因或优势表位；所述狂犬病毒基因片段包括PHD结构域，其编码基因序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，所述包装信号序列的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。