[发明专利]一种含外泌体的湖羊精液冻存液及冻存方法

权利要求书

1.一种湖羊精液冻存液，其特征在于，包含以下浓度的组分：Tris 25～40g/L、柠檬酸15～18g/L、果糖5～15g/L、山梨醇5～20g/L、甘油3～10v/v％、BSA 2～7g/L、湖羊间充质干细胞冻干粉0.2～0.8g/L。

2.如权利要求1所述的湖羊精液冻存液，其特征在于，包含以下浓度的组分：Tris 30～35g/L、柠檬酸15～18g/L、果糖5～10g/L、山梨醇10～20g/L、甘油5～10v/v％、BSA 2～5g/L、间充质干细胞冻干粉0.2～0.5g/L。

3.如权利要求1所述的湖羊精液冻存液，其特征在于，还包括抗生素。

4.如权利要求3所述的湖羊精液冻存液，其特征在于，所述抗生素及使用量如下：青霉素80～100万IU/L、链霉素0.8～1g/L。

5.如权利要求1所述的湖羊精液冻存液，其特征在于，所述湖羊间充质干细胞冻干粉制备方法如下：

(1)无菌条件下收集湖羊脐带；

(2)清洗残留的血液，分离获得华通氏胶，然后将其剪成小块，加入Ⅱ型胶原蛋白酶，于37℃消化得到单细胞悬液，加入PBS终止消化，离心，向细胞沉淀中加入含血清的羊脐带间充质干细胞培养液，吹打均匀后接种于培养板中进行培养；

(3)待步骤(2)中培养的细胞融合度达到80～90％时，对细胞进行传代培养；

(4)取传代至3～5代的细胞，用PBS缓冲液清洗，然后用无血清羊脐带间充质干细胞培养液培养48h，收集培养上清液；

(5)从上述上清液中分离获得外泌体，真空冷冻干燥，得到外泌体冻干粉。

6.如权利要求5所述的湖羊精液冻存液，其特征在于，步骤(5)所述分离获得外泌体的方法为离心法，具体如下：300g离心10min，取上清；2000g离心10min，取上清；10000g离心30min，取上清；100000g离心70min，取沉淀；用PBS重悬沉淀，然后100000g离心70min，收集沉淀，即得所述外泌体。

7.如权利要求1～6任一项所述湖羊精液冻存液在湖羊精液保存中的应用。

8.一种湖羊精液保存方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)取新鲜湖羊精液，将所述精液加入如权利要求1～6任一项所述湖羊精液冻存液中，混合均匀后加入冻存管；

(2)将冻存管于4℃放置1～2h，然后于距离液氮液面4～6cm处放置8～10min，最后投入液氮中进行保存。

9.如权利要求8所述的湖羊精液保存方法，其特征在于，所述步骤(1)冻存管中精子的密度为2×10⁸～6×10⁸个/mL。