[发明专利]一种含外泌体的湖羊精液冻存液及冻存方法

说明书

本发明提供了一种湖羊精液冻存液。所述湖羊精液冻存液包含以下浓度的组分：Tris 25～40g/L、柠檬酸15～18g/L、果糖5～15g/L、山梨醇5～20g/L、甘油3～10v/v％、BSA 2～7g/L、湖羊间充质干细胞冻干粉0.2～0.8g/L。所述湖羊精液冻存液可以有效降低湖羊精液在冻存过程中的损伤和“衰老”现象，能很好地保持精子的活力和顶体完整性。使用本发明冻存液和冻存方法对湖羊精液进行超低温冻存，解冻后精子仍然具有较好的授精能力，受胎效果稳定，可满足湖羊冷冻精液人工授精的要求，具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明属于湖羊养殖技术领域，具体涉及一种含外泌体的湖羊精液冻存液及冻存方法。

背景技术

湖羊是太湖平原重要的家畜之一，是我国一级保护地方畜禽品种。畜牧学分类上为羔皮、肉食兼用的粗毛羊。湖羊在太湖平原的育成和饲养已有八百多年的历史。由于受到太平湖的自然条件和人为选择的影响，逐渐育成独特的一个稀有品种，产区在浙江、江苏间的太湖流域，所以称为湖羊。

为提高湖羊的繁殖效率，充分利用优良种公畜的精液，实际生产中已将人工授精技术应用于湖羊的配种中。但羊的精子和鸡、牛精子相比更加脆弱，在冷冻、解冻过程极易形成损伤，从而失去受精能力。现有羊冷冻精液解冻后活率较低且存在很多“衰老”精子和弱死精子，有效精子少，活力低，质量差，很难满足人工授精的需要。而精液的保存是人工受精技术的核心环节，因此开发一种保存效果好的保存液十分必要。

1983年，外泌体首次于绵羊网织红细胞中被发现，1987年Johnstone将其命名为exosome。现今，外泌体特指直径在40-100nm的盘状囊泡。多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体。其主要来源于细胞内内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。外泌体可携带多种与源细胞相似的蛋白质、mRNA、miRNA，参与免疫调节、细胞通讯、细胞迁移、血管新生等过程。

发明内容

基于此，本发明的目的在于提供一种湖羊精液冻存液，其含有湖羊间充质干细胞冻干粉，在用于湖羊精液冻存时能有效保持湖羊精子的存活率、活力和顶体完整性，有效防止精子的损伤和“衰老”。

具体技术方案为：

一种湖羊精液冻存液，其包含以下浓度的组分：Tris 25～40g/L、柠檬酸 15～18g/L、果糖5～15g/L、山梨醇5～20g/L、甘油3～10v/v％、BSA 2～7g/L、湖羊间充质干细胞冻干粉0.2～0.8g/L。

在其中一些实施例中，所述的湖羊精液冻存液包含以下浓度的组分：Tris 30～35g/L、柠檬酸15～18g/L、果糖5～10g/L、山梨醇10～20g/L、甘油5～10v/v％、 BSA 2～5g/L、间充质干细胞冻干粉0.2～0.5g/L。

在其中一些实施例中，所述的湖羊精液冻存液还包括抗生素。

在其中一些实施例中，所述抗生素及使用量如下：青霉素80～100万IU/L、链霉素0.8～1g/L。

在其中一些实施例中，所述湖羊间充质干细胞冻干粉制备方法如下：

(1)无菌条件下收集湖羊脐带；

(2)清洗残留的血液，分离获得华通氏胶，然后将其剪成小块，加入Ⅱ型胶原蛋白酶，于37℃消化得到单细胞悬液，加入PBS终止消化，离心，向细胞沉淀中加入含血清的羊脐带间充质干细胞培养液，吹打均匀后接种于培养板中进行培养；

(3)待步骤(2)中培养的细胞融合度达到80～90％时，对细胞进行传代培养；

(4)取传代至3～5代的细胞，用PBS缓冲液清洗，然后用无血清羊脐带间充质干细胞培养液培养48h，收集培养上清液；

(5)从上述上清液中分离获得外泌体，真空冷冻干燥，得到外泌体冻干粉。