[发明专利]一种检测李斯特氏菌的CDA引物组、试剂盒及其应用

说明书

本发明公开了一种检测李斯特氏菌的CDA引物组、试剂盒及其应用。所述CDA引物组为针对李斯特氏菌的保守区片段扩增的引物组，为引物对LM‑F2/LM‑R2和/或引物对LM‑MF/LM‑MR；其中，LM‑F2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，LM‑R2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；LM‑MF的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，LM‑MR的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。本发明提供的方法或试剂盒无需昂贵的仪器、也无需复杂的操作就可完成对李斯特氏菌的快速准确检测，因此，适用于专业程度不高的机场、海关、口岸、社区等地的现场快速检测。本发明所提供的可视化试剂盒将为现场检测提供极大便利，可实现对李斯特氏菌快速准确的检测。

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种检测李斯特氏菌的CDA引物组、试剂盒及其应用。

背景技术

李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)是一种革兰染色阳性、兼性厌氧无芽孢杆菌，能在胞内寄生。它主要以食物为传染媒介，是最为致命的食源性病原菌之一。李斯特氏菌的易感人群主要为孕妇、新生儿、老人及免疫缺陷者。它能通过眼睛及破损皮肤、粘膜进入体内，从而造成感染，感染后能穿过人体的肠道、血脑和胎盘三大屏障，从而导致胃肠炎、败血症、脑膜炎等疾病，还会导致女性妊娠期流产，死亡率高达30％。李斯特氏菌分布广泛，可存在于原乳、乳制品、冷冻肉类、家禽以及水果蔬菜中等。国外调查表明，新鲜肉类、肉类制品以及熟食肉类制品中的李斯特氏菌在各类产品中的比例最高。国内调查发现，肉类制品污染李斯特氏菌的比例最高。李斯特氏菌由于在4℃的环境中仍可生长繁殖，成为了冷藏食品中威胁人类健康的主要病原菌之一，同时也成为卫生微生物检验中的一个重要检测目标。

目前李斯特氏菌常用的检测方法主要有生化培养鉴定、血清学检测等。李斯特氏菌的传统检测方法全过程大约需要5-10d，且检出限极低，费时费力，不能及时、灵敏地检测食品中的致病菌，因此也不能用于处理食物突发事件。与李斯特氏菌其他检测法相比，PCR方法具有极好的敏感性，但必需经过选择性增菌以稀释可能干扰检测反应的某些成分，一个完整的以PCR为基础的李斯特氏菌检测法需2d完成。建立一种快速、灵敏、特异的李斯特氏菌检测方法迫在眉睫。

基于闭合颈环介导的核酸恒温扩增技术(Closed Dumbbell mediatedIsothermal Amplification of nucleic acids，CDA)是国科宁波生命与健康产业研究院开发的替代日本LAMP核酸扩增的方法(中国专利申请号：202110473121.8)。该方法主要利用2种不同的特异性引物识别靶基因的特定区域，在等温条件进行扩增反应。与常规基因检测手段(如PCR等)相比，CDA反应在恒温水浴箱便可完成，仪器设备要求低，较传统PCR和培养法操作简单许多，不需要专业人士也可准确完成，适合基层医疗机构及地方检验检疫部门的应用。并且，CDA还可以大大缩短操作时间，减少样品污染机会，适合应用于李斯特氏菌的快速诊断。此外，CDA所用关键成环引物约为30bp，较LAMP中成环引物40bp短，这将极大节省成本。

发明内容

本发明的目的是，提供一种检测李斯特氏菌的CDA引物组、试剂盒及其应用。

本发明为实现上述目的所采用的技术方案如下：

一种非疾病诊断目的的检测李斯特氏菌的CDA引物组，所述CDA引物组为以下引物对中的其中一对引物或两对引物，

引物对LM-F2/LM-R2，其中，LM-F2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，LM-R2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

引物对LM-MF/LM-MR，其中，LM-MF的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，LM-MR的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明还提供一种检测李斯特氏菌的试剂盒，所述试剂盒包括上述的CDA引物组。