[发明专利]饲用微生物产品中菌种及风险基因的高通量检测方法

说明书

本发明属于农业技术领域，具体涉及饲用微生物产品中菌种及风险基因的高通量检测方法。本发明的饲用微生物产品中菌种的高通量检测方法，包括以下步骤：提取待测样品中的微生物的基因组DNA；进行高通量测序；对高通量测序结果进行数据分析，得到每种微生物的丰度；对微生物的丰度进行结果展示，展示结果显示为中文。本发明的方法能有效提取饲用微生物产品中的总DNA，并准确筛选非靶向致病菌，对《饲料添加剂品种目录》中允许使用的菌种含量进行定量分析，可对饲用微生物产品中的耐药基因、可迁移耐药基因和毒力基因进行分析、中文说明目标基因的风险和菌种溯源，有效解决饲用微生物产品存在的问题。

技术领域

本发明属于农业技术领域，具体涉及饲用微生物产品中菌种和风险基因分析及菌种溯源的高通量检测方法。

背景技术

中国是世界上最大的养殖国家，且规模化程度呈不断上升趋势。随着畜牧养殖业的稳定发展和无抗养殖的进程加快，饲用微生物产品作为抗生素的重要替代产品之一，具有良好的市场前景。然而，市场的迅猛发展也带来新的问题，部分企业生产水平较低，致使其产品含有致病微生物，有些企业由于缺乏专业背景，甚至使用《饲料添加剂品种目录(2013)》中36种允许使用的菌种以外的杂菌作为发酵菌种进行大量生产，不但可能因为引发动物疾病导致养殖行业的巨大损失，同时由于部分致病菌可引起人类疾病，对人民生命安全造成严重威胁。

另一方面，由于缺乏有效的检测手段，有些企业使用的生产菌株虽然属于《饲料添加剂品种目录(2013)》中允许使用的菌种，但含有大量风险基因，如毒力基因、耐药基因和可迁移耐药基因，不但引起环境的污染，对人畜造成威胁，甚至可通过基因转移，产生超级耐药菌，加速现有抗生素的失效，使人类最终无药可医。而产品中的污染菌同样含有上述风险基因，因此需要建立产品及生产菌株中风险基因的检测及菌种溯源的分析方法，以快速有效查找饲用微生物产品的风险点，为消费者严格把关，为企业提高质量控制水平。

目前饲用微生物产品存在以下问题：(1)部分产品含有致病菌，造成使用风险；(2)部分产品纯度不够，目标菌含量偏低；(3)部分产品存在使用菌种与标识不符，存在安全隐患；(4)生产菌株及产品含有毒力基因、耐药基因和可迁移耐药基因等风险基因。

现有检测手段和相应标准不能有效分析未知致病菌，不具备非靶向检测功能。传统的方法存在较大局限性：通过平板计数检测度纯度，工作量大，且准确性差。平板计数大多属于靶向检测，一次只能有针对性检测一种。使用营养琼脂类的广谱类培养基也不能反映产品的全面情况，同时分离鉴定的工作量巨大且耗时长；对于低菌量的菌更是无法检测出来。16s rRNA测序鉴定菌种的分辨率不足。16s rRNA测序曾被视为菌种分子鉴定的金标准。但是，由于大量新菌种的发现，而16s rRNA基因的全长仅为1500bp左右，因此现在越来越多的菌种，尤其是乳酸菌的鉴定，仅靠16s rRNA测序，是难以区分的。PCR技术鉴定菌株中的毒力基因和耐药基因，成本较高，且存在假阳性。针对饲用微生物产品及生产菌株目前尚无成熟的技术用于分析风险基因的菌种溯源，尤其是可迁移耐药的溯源。Hi-C测序技术虽然可以做到毒力基因和耐药基因的菌种溯源，但成本较高，且技术尚不成熟。

综上，现有技术中没有针对饲用微生物产品中杂菌或致病菌的非靶向检测方法和对于《饲料添加剂品种目录(2013)》中36种菌种的定量方法，也没有针对饲用微生物产品中耐药基因、可迁移耐药基因和毒力基因进行分析、中文解释目标基因风险和低成本菌种溯源的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种适用于饲用微生物产品的菌种的高通量检测方法。

本发明的再一目的在于提供一种适用于饲用微生物产品中风险基因的高通量检测及菌种溯源方法。

根据本发明具体实施方式的饲用微生物产品中菌种的高通量检测方法，所述方法包括以下步骤：

(1)提取待测样品中的微生物的基因组DNA；

(2)对步骤(1)提取得到的基因组DNA进行高通量测序；