[发明专利]用于高通量测序的微生物饲料添加剂的核酸提取方法

说明书

本发明属于农业技术领域，具体涉及用于高通量测序的微生物饲料添加剂的核酸提取方法。本发明用于高通量测序的微生物饲料添加剂的核酸提取方法，包括以下步骤：取样品后进行清洗；裂解样品中的微生物；去除样品中的RNA；去除样品中的蛋白质；吸附DNA，进行清洗。本发明方法提取微生物饲料添加剂得到的核酸纯度高、完整度高,可用于后续的高通量测序分析。

技术领域

本发明属于农业技术领域，具体涉及用于高通量测序的微生物饲料添加剂的核酸提取方法。

背景技术

在全面禁止使用抗生素的背景下，我国药物饲料添加剂将在2020年全部退出，微生物饲料添加剂是抗生素的最佳替代品。然而，微生物饲料添加剂产品普遍存在如下安全问题：(1)产品中功能菌比例不高，含有杂菌、甚至致病菌；(2)菌种(甚至是菌属)标识错误；(3)功能菌含有耐药基因；(4)功能菌含有毒力基因；(5)功能菌在生产过程中发生突变、退化，失去原有功效。

现有技术评估微生物饲料添加剂安全性方法尚未成熟，传统的检测手段存在劳动量大、效率低、准确度差、通量不高等缺点。因此，建立轻松、高效、精准、高通的评估方法，迫在眉睫。

高通量测序作为新一代测序技术，能够有效评估上述微生物饲料添加剂产品的安全问题，从而为微生物饲料添加剂市场的规范和管理提供保障。然而，由于微生物饲料添加剂的组成成分比较复杂，其中包括大量的宿主DNA、蛋白质、多糖、脂质、无机盐等，建立高通量测序方法首先面临的棘手问题是饲料中微生物核酸的提取。

现有的核酸提取方法主要是针对土壤、动物、植物、微生物等样品建立的通用方法。面对微生物饲料添加剂这种复杂基质无法获得纯度高、完整度高的核酸，不能满足后续的高通量测序的建库要求。现有技术所使用的微生物饲料添加剂的核酸提取方法多为进口试剂盒，而试剂盒提取的效果差，样品无法进行测序分析，限制了微生物饲料添加剂安全性的评估，大大阻碍了该市场的管理和行业发展。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于高通量测序的微生物饲料添加剂的核酸提取方法。

根据本发明具体实施方式的用于高通量测序的微生物饲料添加剂的核酸提取方法，包括以下步骤：

(1)取样品，用TE缓冲液清洗样品；

(2)裂解样品中的微生物；

(3)向步骤(2)所得的样品中加入核糖核酸酶，去除样品中的RNA；

(4)向步骤(3)所得的样品中加入蛋白酶，去除样品中的蛋白质；

(5)向步骤(4)所得样品中加入磁珠混合液，吸附细菌DNA，其中，磁珠混合液包括磁珠和PEG，磁珠和PEG的体积比为1：1～4；

(6)清洗步骤(5)所得的DNA。

本发明的方法适用的样品不限于微生物饲料添加剂，还包括其他添加有饲用微生物菌种的样品，例如，市售固体、液体、半固体(膏状)微生物饲料添加剂及产品生产过程中的中间产物，如生产菌株、发酵物、包装前产品等饲用微生物产品。

根据本发明具体实施方式的用于高通量测序的微生物饲料添加剂的核酸提取方法，步骤(1)中，用10×TE缓冲液清洗样品。

本发明利用10倍TE溶液对菌体进行清洗，使环境中的金属离子被大量螯合，降低了核酸酶的活性，清洗掉样品中的游离DNA和杂质，使终产物的产量增加且降低宿主DNA的污染；保留了提取得到的总DNA的完整性。

其中，TE缓冲液是Tris+EDTA缓冲液，10×TE缓冲液为TE缓冲液的10倍浓度液，试剂组成为Tris-HCl(100mM)，EDTA(10mM)，pH8.0。