[发明专利]一种桑白蚧微卫星标记开发方法

权利要求书

1.一种桑白蚧微卫星标记开发方法，其特征在于：具体包括以下步骤：

步骤一：收集固着与植株枝干表面的雌成虫虫体50头，用液氮保存，存于-80℃冰箱中备用；

步骤二：进行总RNA的提取；

步骤三：利用TakaraM-MLV反转录试剂盒进行cDNA合成；

步骤四：用检测合格的样本送至测序公司进行转录组测序，组合拼接序列，得到DNA序列结果，继而采用Trinity软件对DNA序列进行组装拼接成unigenes；

步骤五：利用SSR软件MicroSAtellite找出微卫星序列，用Primer3软件在核心序列两侧设计引物并合成；

步骤六：利用温度梯度PCR进行引物退火温度的优化，根据引物合成的引物合成时的温度±5℃进行退火温度的筛选，扩增出引物设计时的目的片段的大小；

步骤七：利用8个不同地点中的每个地点中的单头桑白蚧提取的DNA进行PCR扩增后进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，利用凝胶成像分析仪进行条带分析，有多条带的为多态性微卫星引物；

步骤八：利用筛选得到的多态性引物对80头虫子的DNA进行PCR扩增，进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，统计凝胶成像系统条带结果，进行条带分析，评估多态性，分析桑白蚧遗传结构，评估不同种群桑白蚧的遗传多样性。

2.如权利要求1所述的一种桑白蚧微卫星标记开发方法，其特征在于：步骤二中的总RNA的提取步骤为：

①将1ml BufferRlysis-A加入1.5ml RNase-free的离心管中备用；

②取50mg桑白蚧组织用液氮研磨成粉末，加到上述1.5ml离心管中，立即震荡混匀，室温放置3min；

③向裂解样品中加入200μl氯仿，充分混匀，12000rpm、4℃、离心5min，取上清；

④加入1/3体积无水乙醇，混匀，室温放置3min，12000rpm、4℃、离心5min，倒掉上清；

⑤用700μl的75％乙醇洗涤沉淀，12000rpm、4℃、离心3min，倒掉上清；

⑥重复上面步骤⑤一次，室温倒置10min，使离心管中残留的乙醇彻底挥发，加入50μl的DEPC-treated ddH2O溶解沉淀，立即使用或-70℃长期保存；

⑦提取得到的总RNA用1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测后，用Bio-RAD凝胶成像系统进行拍照保存，并且用微量核酸检测仪检测总RNA的纯度和浓度。

3.如权利要求1所述的一种桑白蚧微卫星标记开发方法，其特征在于：步骤三中的cDNA的合成步骤为：

①取测定浓度的RNA溶液，取含有1μg RNA的溶液，加入1μl浓度为25μM的随机引物，加RNase-Free的水补充体积到6μ；

②混合均匀后，将混合液置于70℃加热10min；

③取出样品，放置在冰上2min，冷却；

④依次加入2μl的5×M-MLVbuffer、0.5μl的浓度为10mM的dNTP、0.25μl的浓度为40U/μl的RNase抑制剂、200U的M-MLV反转录酶，加水补齐到10μl，混匀；

⑤将混匀的液体置于30℃加热10min，42℃加热1h，70℃加热15min。