[发明专利]一种桑白蚧微卫星标记开发方法

说明书

本发明公开了一种桑白蚧微卫星标记开发方法，包括收集雌成虫虫体50头；进行总RNA的提取；进行cDNA合成；进行转录组测序，组合拼接序列，得到DNA序列结果，进行组装拼接成unigenes；找出微卫星序列，在核心序列两侧设计引物并合成；进行引物退火温度的优化，进行退火温度的筛选，扩增出引物设计时的目的片段的大小；单头桑白蚧提取的DNA进行PCR扩增后进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，进行条带分析；对80头虫子的DNA进行PCR扩增，进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。该发明的技术效果为使用桑白蚧转录组测序技术，对基因组数据生物信息缺乏的桑白蚧进行微卫星开发，对桑白蚧微卫星位点进行深度挖掘，验证微卫星分子标记的多态性。

技术领域

本发明涉及生物微卫星标记技术领域，具体为一种桑白蚧微卫星标记开发方法。

背景技术

SSR(simple sequence repeat，SSR)分子标记，又称为简单重复序列或者微卫星序列，通常包含1-6bp碱基，是一段有重复基元组成的DNA序列，在生物遗传学的研究中已经有了很广泛的应用，因为它具有很好的多态性及共显性的特点，在基因中的数量也比较丰富。传统的SSR标记开发方法主要包括微卫星富集法、PCR分离法、同源序列借鉴法、基因组文库测序法、省略筛库法和数据库搜索法。微卫星富集法需构建和筛选基因组文库,操作过程比较繁琐，耗时长且成功率低，成本高；PCR分离法操作过程复杂，实验过程需要投入大量的精力和时间且实验中易发生污染；同源序列借鉴法耗时耗力，通用性低，并且在应用上有一定限制；基因组文库测序法其位点在基因组中覆盖率低，对设备要求高，成本高；省略筛库法操作过程繁琐，开发出的引物特异性低；数据库搜索法只限于在已有序列公布的物种中应用，具有局限性。

桑白蚧，Pseudaulacaspis pentagona(Targioni-Tozzetti)又被称作桑拟轮蚧，桑盾蚧，隶属于半翅目Hemiptera，蚧总科Coccoidea，盾蚧科Diaspididae，拟白轮盾蚧属，是一种果园常见的拟寄主性害虫，广泛分布于热带、亚热带和温带地区。该害虫是典型的多食性害虫，可以取食超过85科221属的植物，桑白蚧是食性最杂的盾蚧之一，桑白蚧有极大的危害性。由于桑白蚧寄主广泛，伴随着经济的不断发展，果树苗木调运的日趋频繁，桑白蚧通过我国各省和世界各国之间相互引进的苗木和果品迅速蔓延，危害范围日趋扩大。

在当前的研究中，目前桑白蚧的微卫星标记尚未见报道，桑白蚧微卫星的研究还处于空白状态，由于分子标记的缺失，严重的阻碍了桑白蚧防治策略的制定，不能对桑白蚧的种群遗传结构和种群遗传多样性提供数据支撑。

发明内容

本发明的目的在于提供一种桑白蚧微卫星标记开发方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，发明提供如下技术方案：一种桑白蚧微卫星标记开发方法，具体包括以下步骤：

步骤一：收集固着与植株枝干表面的雌成虫虫体50头，用液氮保存，存于-80℃冰箱中备用；

步骤二：进行总RNA的提取；

步骤三：利用TakaraM-MLV反转录试剂盒进行cDNA合成；

步骤四：用检测合格的样本送至测序公司进行转录组测序，组合拼接序列，得到DNA序列结果，继而采用Trinity软件对DNA序列进行组装拼接成unigenes；

步骤五：利用SSR软件MicroSAtellite找出微卫星序列，用Primer3软件在核心序列两侧设计引物并合成；

步骤六：利用温度梯度PCR进行引物退火温度的优化，根据引物合成的引物合成时的温度±5℃进行退火温度的筛选，扩增出引物设计时的目的片段的大小；

步骤七：利用8个不同地点中的每个地点中的单头桑白蚧提取的DNA进行PCR扩增后进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，利用凝胶成像分析仪进行条带分析，有多条带的为多态性微卫星引物；