[发明专利]一种分泌表达重组蝽防御素THA的重组毕赤酵母及其构建和表达方法

权利要求书

1.一种分泌表达重组蝽防御素THA的重组毕赤酵母，其特征在于，所述重组毕赤酵母(Pichia pastoris)保藏编号为GDMCC No.61977。

2.一种构建重组毕赤酵母的方法，其特征在于，用于构建权利要求1所述的分泌表达重组蝽防御素THA的重组毕赤酵母，包括以下步骤：

步骤S001.设计重组蝽防御素THA编码基因：以THA成熟肽序列为目标产物，根据毕赤酵母密码子偏好性设计THA编码基因；

步骤S002.构建表达载体：将步骤S001中设计得到的THA编码基因分别连接至载体pPICZαA和pPIC3.5K，分别构建pPICZαA-THA和pPIC3.5K-THA表达载体；

步骤S003.构建重组毕赤酵母：分别对pPICZαA-THA和pPIC3.5K-THA表达载体进行线性化处理，然后将pPICZαA-THA线性化表达载体转入毕赤酵母感受态细胞，将转化后的毕赤酵母接种至筛选培养基培养，得到单菌落后进行菌株表达量检测，挑选出最优菌株THA-1；再将pPIC3.5K-THA线性化表达载体转入菌株THA-1感受态细胞，经过筛选培养基培养得到单菌落后再次进行菌株表达量检测，挑选出最优菌株THA-2，获得所述分泌表达重组蝽防御素THA的重组毕赤酵母。

3.根据权利要求2所述的构建重组毕赤酵母的方法，其特征在于，所述步骤S001中，所述THA编码基因序列为SEQ ID NO.2。

4.根据权利要求2所述的构建重组毕赤酵母的方法，其特征在于，所述步骤S002中，所述pPICZαA-THA表达载体的构建包括以下步骤：在THA编码基因序列的5’端添加XhoI序列，3’端添加XbaI序列，然后用限制性内切酶XhoI和XbaI进行双酶切处理，再用T4DNA连接酶将经双酶切处理的THA编码基因连接至同样用XhoI和XbaI双酶切处理的线性化pPICZαA载体，构建所述pPICZαA-THA表达载体。

5.根据权利要求2所述的构建重组毕赤酵母的方法，其特征在于，所述步骤S002中，所述pPIC3.5K-THA表达载体的构建包括以下步骤：在THA编码基因序列的5’端添加α-因子分泌信号肽序列，然后在该信号肽的起始密码子前添加BamHI序列，在THA编码基因序列的3’端添加NotI序列，得到融合序列，然后用限制性内切酶BamHI和NotI进行双酶切处理，再用T4 DNA连接酶将经双酶切处理的THA编码基因连接至同样用BamHI和NotI双酶切处理的线性化pPIC3.5K载体，构建所述pPIC3.5K-THA表达载体。

6.根据权利要求2所述的构建重组毕赤酵母的方法，其特征在于，所述步骤S003中，所述pPICZαA-THA和pPIC3.5K-THA线性化表达载体通过电转化转入感受态细胞。

7.根据权利要求2所述的构建重组毕赤酵母的方法，其特征在于，所述步骤S003中，所述pPICZαA-THA表达载体采用PmeI限制性内切酶进行线性化处理。

8.根据权利要求2所述的构建重组毕赤酵母的方法，其特征在于，所述步骤S003中，所述pPIC3.5K-THA表达载体采用SalI限制性内切酶进行线性化处理。

9.根据权利要求2所述的构建重组毕赤酵母的方法，其特征在于，所述步骤S003中，菌株表达量检测包括以下步骤：挑取单菌落进行培养，稳定后用1％甲醇诱导48小时，然后收集发酵上清液，上清液离心后用于检测抑菌圈大小，选择出表达量最优的菌株。

10.一种重组毕赤酵母的诱导表达方法，其特征在于，用于权利要求1所述的重组毕赤酵母分泌表达重组蝽防御素THA，包括以下步骤：

步骤S101.一级培养：将重组毕赤酵母接种于25mL BMGY培养基中，在30℃、220rpm的条件下培养24小时，获得一级种子液；

步骤S102.二级培养：取20mL一级种子液接种于200mL BMGY培养基中，在30℃、220rpm的条件下培养24小时，获得二级种子液；

步骤S103.三级培养：将二级种子液全部接种于含有2L BSM培养基的发酵罐中进行培养，培养时，温度控制在29.5-30.5℃，溶氧控制在19.5-20.5％，pH控制在4.5-5.5；

步骤S104.诱导表达：当BSM培养基的甘油耗尽后，流加10％甘油，甘油耗尽后待溶氧上升至100％，饥饿1小时，然后流加甲醇诱导THA表达，诱导时间为96小时，温度控制在25.5-26.5℃，pH控制在4-4.5。