[发明专利]一种分泌表达重组蝽防御素THA的重组毕赤酵母及其构建和表达方法

说明书

本发明公开了一种分泌表达重组蝽防御素THA的重组毕赤酵母及其构建和表达方法。所述重组毕赤酵母通过在基因组两个不同位点插入THA表达盒构建获得，遗传性能稳定，THA表达量高，经检测可达1.5g/L以上，为现有技术的两倍以上。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，特别涉及一种分泌表达重组蝽防御素THA 的重组毕赤酵母及其构建方法。

背景技术

蝽防御素Thanatin(THA)是法国科学家在1996年从受到大肠杆菌或藤黄微球菌侵染24小时后的半翅目昆虫斑腹刺益蝽(Podisus maculiventris)体内血淋巴中发现的一种对某些革兰氏阴性菌，革兰氏阳性菌和真菌均具有抑菌活性的抗菌肽。成熟的THA由21个氨基酸组成，序列为GSKKPVPIIYCNRRTGKCQRM。THA在溶液中包含一个由两个反平行的β- 折叠形成的空间结构，其空间结构由第11位和18位半胱氨酸形成的一个二硫键(Cys11-Cys18)保持稳定。研究表明，THA对大肠杆菌，沙门氏菌，藤黄微球菌，白色念珠菌等均有较强的抑菌活性。作为一种抑菌物质，THA 在医药、食品、饲料等领域均有潜在的应用价值。

要实际应用THA，就必须建立大规模生产的方法。THA可以通过三种途径获取：生物提取，化学合成和生物合成。斑腹刺益蝽天然产生的THA非常少，因此通过提取方式生产THA不可行。而通过化学合成方式获取THA，目前其生产成本过高。生物合成主要通过基因工程手段构建能够异源表达 THA的工程菌株，然后通过工业规模的发酵进行大量生产。毕赤酵母由于易于培养、分泌能力强且分泌产物中杂蛋白含量较低，已被用于多种重组多肽和蛋白质的工业化生产。梁伟凡等前期已经构建了通过在毕赤酵母醇氧化酶基因位点插入重组THA表达盒的工程菌(CN 107904182A)，但发酵表达量不高，THA含量为0.6g/L。而他们在单位点插入重组THA表达盒的工程菌的基础上，利用紫外线诱变获得的工程菌株(CN108342334A)，其THA分泌表达量虽有所提高(THA含量达到0.76g/L)，但其表达量依旧不高，且在后续发酵生产过程中发现其遗传性状不稳定。

可见，现有技术还有待改进和提高。

发明内容

鉴于上述现有技术的不足之处，本发明的目的在于提供一种分泌表达重组蝽防御素THA的重组毕赤酵母及其构建方法，旨在解决现有技术中蝽防御素THA重组毕赤酵母的表达量低以及遗传性状不稳定的问题。

为了达到上述目的，本发明采取了以下技术方案：

一种分泌表达重组蝽防御素THA的重组毕赤酵母，所述重组毕赤酵母 (Pichiapastoris)保藏编号为GDMCC No.61977。

一种构建重组毕赤酵母的方法，用于构建上述的分泌表达重组蝽防御素THA的重组毕赤酵母，包括以下步骤：

步骤S001.设计重组蝽防御素THA编码基因：以THA成熟肽序列为目标产物，根据毕赤酵母密码子偏好性设计THA编码基因；

步骤S002.构建表达载体：将步骤S001中设计得到的THA编码基因分别连接至载体pPICZαA和pPIC3.5K，分别构建pPICZαA-THA和 pPIC3.5K-THA表达载体；

步骤S003.构建重组毕赤酵母：分别对pPICZαA-THA和pPIC3.5K-THA 表达载体进行线性化处理，然后将pPICZαA-THA线性化表达载体转入毕赤酵母感受态细胞，将转化后的毕赤酵母接种至筛选培养基培养，得到单菌落后进行菌株表达量检测，挑选出最优菌株THA-1；再将pPIC3.5K-THA线性化表达载体转入菌株THA-1感受态细胞，经过筛选培养基培养得到单菌落后再次进行菌株表达量检测，挑选出最优菌株THA-2，获得所述分泌表达重组蝽防御素THA的重组毕赤酵母。

所述的构建重组毕赤酵母的方法，其中，所述步骤S001中，所述THA 编码基因序列为SEQ ID NO.2。