[发明专利]桑花叶型矮缩相关双生病毒的LAMP检测引物组及其可视化检测方法

说明书

本发明公布了一种桑花叶型矮缩相关双生病毒的LAMP检测引物组及其可视化检测方法，用于桑花叶型矮缩相关双生病毒的特异性检测。该检测引物组是根据桑花叶型矮缩相关双生病毒编码的V2基因序列设计，V2基因序列如Seq ID NO：1所示，包括以下三组引物：FIP、BIP、F3、B3、LF、LB，序列分别为SEQ ID NO：2～7所示。通过DNA提取、LAMP恒温扩增后显色反应或琼脂糖凝胶电泳后可产生阶梯状条带。本发明针对桑花叶型矮缩相关双生病毒建立的可视化检测方法具有扩增快速高效、特异性好、操作简便、不需要特殊仪器等优点，为桑花叶型矮缩相关双生病毒防治提供技术依据。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种单链DNA病毒，双生病毒科，桑花叶型矮缩相关病毒(Mulberry mosaic dwarf-associated virus,MMDaV)的LAMP检测引物组及其可视化检测方法。

背景技术

桑花叶型矮缩相关病毒(Mulberry mosaic dwarf-associated virus,MMDaV)是严重影响桑树的生长和桑叶产量的一种单组份双生病毒，该病害发生时，桑树呈现矮化、叶片黄化皱缩、等症状。MMDaV的基因组是大小为2952nt的单链环状DNA分子，病毒链含有5个ORF(V1、V2、V3、V4和V5)：V1可能编码衣壳蛋白，V2编码的蛋白为RNA沉默抑制子，V3、V4和V5的序列与已知的双生病毒序列的同源性很低，其编码的蛋白的功能还不明确；互补链含有2个ORF(C1和C1：C2)，其编码的蛋白可诱导细胞死亡，也可能参与病毒的复制。MMDaV的病毒链与互补链之间为基因间隔区，含有病毒复制和转录的起始位点。

目前，主要利用聚合酶链式反应(PCR)检测MMDaV，但PCR需要昂贵的仪器和训练有素的科研人员，费时费力。

因此，开发一种新的灵敏、快速、准确、便捷的诊断技术快速鉴定MMDaV对桑叶生产和桑蚕产业的发展都具有重要意义。

发明内容

本发明的第一个目的是提供桑花叶型矮缩相关双生病毒(Mulberry mosaicdwarf-associated virus,MMDaV)的LAMP检测引物组。

本发明的第二个目的是提供桑花叶型矮缩相关双生病毒的LAMP可视化检测方法及其应用。环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是一种新型的核酸扩增方法，可在65℃等温条件下进行扩增，特异性高，灵敏度强，操作简便。本发明根据MMDaV的V2蛋白的基因序列设计了LAMP引物并建立了检测方法，可对该病毒实施准确、灵敏、快速的检测。这对于提高桑树生产和潜在的防治措施(如无毒苗的培育)的制定具有重要意义。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案具体如下：

桑花叶型矮缩相关双生病毒的LAMP检测引物组，基于MMDaV V2基因序列，用LAMP引物设计软件primer explorer(http://primerexplorer.jp/lampv5e/index.html)设计引物，得到三组引物：

FIP：5'-GACTCGAACAGTCCTGGGCCT-CTGAGATCAAGGCGGGGA-3'

BIP：5'-GTTGCAAGTGCCATGCGAACC-GGCCGTCTCTTCCTTCTTG-3'

F3：5'-TGATTACCAGGAGCTCTGCT-3'

B3：5'-GTTTCACTGGGCCCAACG-3'

LF：5'-CCGTGGAATGGTTCCTGGATTC-3'

LB：5'-CGTGGAGAAGAAGAGGCCCAAG-3'