[发明专利]一种重组人源化胶原蛋白及其纯化和内毒素去除方法

说明书

本发明公开了一种重组人源化胶原蛋白及其纯化和内毒素去除方法，涉及生物工程技术领域；本发明首次采用复合阳离子交换填料pH梯度洗脱达到一步去除内毒素并获取高纯度目标蛋白的效果，在精细纯化过程中采用pH值7.0～7.5的磷酸盐缓冲液作为流动相B1，可将杂蛋白及内毒素洗脱干净；采用经碱试剂调节pH值至8.0～8.5的注射用水作为流动相B2，既可洗脱目标蛋白，又避免了采用常规含氯化钠缓冲液洗脱目标蛋白的弊端，在后续纯化步骤中无需进行长时间的脱盐过程，且得到的产品中目标蛋白含量较高，极大的简化纯化工艺，缩短纯化时间，是一种理想的大规模生产重组人源化胶原蛋白的纯化和内毒素去除方法。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种重组人源化胶原蛋白及其纯化和内毒素去除方法。

背景技术

胶原蛋白(collagen)是体内含量最多的一种蛋白质，约占蛋白质总量的25％～33％，其广泛分布于集体各个组织器官，如皮肤、骨骼、角膜、血管等，尤其在人体的皮肤和结缔组织中，含有大量的胶原蛋白。胶原蛋白作为一种结缔组织的粘合物质，对维护细胞、组织、器官的正常生理功能有重要作用。重组胶原蛋白以其天然的止血、低毒性、低抗原型、低免疫性、能引导细胞再生和与人体相容性较好等优点，而广泛应用于生物医药、化妆品、食品等行业中。

在现有技术中，重组胶原蛋白的层析纯化过程基本是采用盐离子梯度洗脱的离子交换层析，此过程洗脱的目标蛋白若未经脱盐处理直接冷冻干燥，将导致冻干成品中蛋白含量低，影响产品在其他领域的直接使用；另一方面，在重组胶原蛋白的生产过程中，现有技术虽有利用热处理等方法降低粗品滤液中内毒素含量的报道，但随着行业的发展，此类方法对内毒素的去除效果远不能达到产品在医疗器械及药品领域的使用要求，在医疗器械或药品开发过程中需要对原料进一步的去除内毒素，才能达到相应的使用要求，极大限制了重组胶原蛋白的应用。

发明内容

为克服现有的技术缺陷，本发明的目的在于提供一种重组人源化胶原蛋白及其纯化和内毒素去除方法，本发明的去除方法具有纯化工艺简单、稳定以及成本低廉的优点。

为了解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：

第一方面，提供了一种重组人源化胶原蛋白的纯化和内毒素去除方法包括以下步骤：

(1)将重组人源化胶原蛋白发酵液在搅拌下加热至80～85℃并保持20～30min；

(2)将步骤(1)处理后发酵液经高速离心机离心固液分离，去除菌体及高温变性杂蛋白，收集上清液，所得上清液用0.22μm中空纤维膜进行过滤澄清，滤出液用碱试剂调节pH值至5.5～6.0，用纯化水调节溶液电导率至6.5～7mS/cm；

(3)将步骤(2)所得的滤出液经复合型弱阳离子交换层析柱层析纯化，洗脱过程采用流动相B1洗脱内毒素及杂质，流动相B2洗脱重组人源化胶原蛋白，洗脱液经冷冻干燥即可得重组人源化胶原蛋白；

所述流动相B1为pH值7.0～7.5的磷酸盐缓冲液；所述流动相B2为用碱试剂调节pH值至8.0～8.5的注射用水。

本发明的重组人源化胶原蛋白为III型胶原蛋白，所述重组人源化胶原蛋白的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，氨基酸数量为681个，分子量为60.22KDa，PI为8.73。

进一步地，上述磷酸盐缓冲液采用注射水配制。

进一步地，上述磷酸盐缓冲液的浓度为5～15mmol；优选地，上述磷酸盐缓冲液的浓度为10mmol。

进一步地，在步骤(2)或步骤(3)中，所述碱试剂为氢氧化钠、氢氧化钾或氢氧化镁等常用碱试剂；优选地，所述碱试剂为氢氧化钠。

进一步地，步骤(3)中，所述复合型弱阳离子交换层析柱为采用流动相A平衡后的复合型弱阳离子交换层析柱。

进一步地，所述流动相A为磷酸盐缓冲液。