[发明专利]一种降低长片段序列合成的突变率的方法在审
| 申请号： | 202111564927.4 | 申请日： | 2021-12-20 |
| 公开（公告）号： | CN114292891A | 公开（公告）日： | 2022-04-08 |
| 发明（设计）人： | 马石金;肖晓文;王早霞;谢天;杜军 | 申请（专利权）人： | 北京擎科生物科技有限公司 |
| 主分类号： | C12P19/34 | 分类号： | C12P19/34;C12Q1/686;C12Q1/6806 |
| 代理公司： | 北京路浩知识产权代理有限公司 11002 | 代理人： | 李梦楠 |
| 地址： | 100176 北京市大兴区经*** | 国省代码： | 北京;11 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 降低 片段 序列 合成 突变 方法 | ||
1.降低长片段序列合成的突变率的方法，所述方法包括：
(1)将用于合成长片段序列的所有寡核苷酸引物序列统一；
(2)使用合成仪合成寡核苷酸引物序列；
(3)将合成的寡核苷酸引物从固相载体上分离；
(4)将获得的长度相同的寡核苷酸引物混合，回收纯化；
(5)纯化的寡核苷酸引物进行酶切，切除多余的T/N碱基；获得的寡核苷酸引物以合成长片段序列。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，寡核苷酸引物序列长度为60-120nt，优选90-110nt，更优选110nt。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，统一引物序列过程中，不足部分由dspace+T/N补充。
4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，步骤(4)中采用PAGE纯化法进行寡核苷酸引物的纯化。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，PAGE纯化法采用交连的聚丙烯酰胺凝胶作为纯化基质。
6.根据权利要求1-5任一所述的方法，其特征在于，步骤(5)中采用核酸内切酶V进行酶切，37℃反应1h，65℃灭活。
7.根据权利要求1-6任一所述的方法，其特征在于，步骤(5)中，利用纯化获得的寡核苷酸引物合成长片段序列的方法为：将目的基因的所有混合引物进行第一轮PCR扩增；第一轮产物直接加入首尾引物进行第二轮PCR扩增；第二轮产物进行磁珠凝胶回收，得到PCR产物，可用于后续连接转化。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，两次PCR扩增的方法为：
①98℃3min；
②98℃10s,60℃-1℃/每循环10s,72℃10s；步骤②10个循环，进入步骤③，
③98℃10s,50℃10s,72℃10s；步骤③15个循环，进入步骤④；
④72℃1min。
9.权利要求1-8任一所述的方法在降低合成的长片段序列突变率、或提高合成长片段序列正确率、准确度中的应用。
10.权利要求1-8任一所述的方法在合成长片段序列中的应用。
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