[发明专利]一种降低长片段序列合成的突变率的方法

说明书

本发明提供一种降低长片段序列合成的突变率的方法，所述方法包括：(1)获得长度统一的寡核苷酸引物序列；(2)使用合成仪进行合成；(3)将合成的寡核苷酸引物从固相载体上分离；(4)将获得的长度相同引物混合，回收纯化；纯化的寡核苷酸引物进行酶切，切除多余的T/N碱基；(5)进行Overlap PCR以合成长片段序列。本发明方法只需做一次胶回收、酶切即可获得所有长度一致的引物，降低引物合成的错误率，后续长片段序列合成中能够极大降低长片段合成的错误率，提高合成正确率，降低了合成成本、缩短了合成周期；并可以大大提升后续合成长片段合成的通量。

技术领域

本发明涉及生物合成技术领域，具体涉及一种降低长片段序列合成的突变率的方法。

背景技术

在长片段序列合成的技术中，通常采用聚合酶链式反应法和连接链式反应法。人工合成基因最基本的技术(目前应用最为广泛的)就是利用重叠PCR(Overlap PCR)的方法。Overlap PCR方法合成基因片段需要确保合成DNA分子含有正确的核苷酸序列，因此如何降低长片段序列合成中的突变率对于该技术的推广应用及发展至关重要。例如，在合成用于功能多肽的基因表达的DNA编码序列时，尤其需要准确的DNA序列，这是因为即使一个核苷酸的取代、插入或缺失都可对最终生成的多肽的功能造成重大影响甚至是颠覆性的后果。因此，降低长片段序列合成中的突变率或者说提高长片段序列合成的准确率是核苷酸片段合成技术领域的技术人员普遍追求的目标。

目前在对降低长片段序列合成中的突变率的研究中，本领域技术人员普遍把注意力集中在长片段序列的合成工艺的改进，以及合成原料的质量提高方面。比如提高制备引物的试剂的质量，选用高质量的合成仪器，提高引物的纯度；缩短引物长度；采用高保真的DNA聚合酶；合成之后再纠错；合成为长链并连到载体之后再修复突变；使用耦合随机碱基UMI到位点特异性引物的5’端进行纠错，进行2～3轮扩增得到完整的高通量测序文库结构；但这些方法成本高，序列错误率依然存在。

现有技术还存在采用核酸分子纠错的方法，通过暴露于单向错配内切核酸酶来使具有核苷酸错配的第一多个双链核酸分子片段化，用内切核酸酶在错配位点或附近切割核酸分子，留下在分子的末端或近末端具有错配的双链核酸分子，然后将核酸分子暴露于在5’至3’或3’至5’方向具有单向活性的外切核酸酶，从而去除错配核苷酸。由去除了错配核苷酸的核酸组装第二多个双链核酸分子，然后直接或在后续扩增步骤，通过例如DNA聚合酶的作用填充所缺失的核苷酸，并重复这些步骤多次。结果是与第一多个核酸分子相比，双链核酸分子的核苷酸错配频率降低。但这种方法类似于亡羊补牢，即寻找合成后的错配，进行纠错，且纠错方法操作繁琐，成本也高，仍然不能化被动为主动，从根本上解决合成长片段的突变率高的情况。

申请人经过长期研究发现：在目前合成寡核苷酸引物过程常用的192合成仪，768合成仪等合成寡核苷酸片段的仪器。该类仪器一次运行有192个、768个通道同时进行合成反应。使用这类合成仪中，如果合成的引物长度不一致，则导致各管道加压分布变得不均匀，使得单体与单体、单体与试剂间的反应时间发生变化，反应不充分，大大增加合成过程中的突变率(突变、缺失、移位等)。

通常对于长的寡核苷酸的纯化(50-120nt)，推荐PAGE纯化法，它使用交连的聚丙烯酰胺凝胶(电泳)作为纯化基质，PAGE显示出高的纯化效率(＞98％)。但是由于长片段合成一般后续实验(Overlap PCR)中所需寡核苷酸引物的量非常少，从合成成本的角度考虑，利用合成仪仅进行小OD的合成即可满足后续合成要求，但如果仅合成小OD的寡核苷酸引物并不能满足PAGE纯化法中切胶回收这一步的操作(寡核苷酸引物合成的量不能达到凝胶电泳后凝胶成像仪上肉眼可分辨的程度)。因此目前合成寡核苷酸引物(60nt-120nt)后采用的是脱盐(OPC)的方式进行纯化。在必要的去保护步骤完成后，寡核苷酸混合物还包含几种必须被去除的小分子有机化合物。所有非必须有机化合物被移除的过程通常叫做脱盐。脱盐纯化可以借助反向硅胶柱进行。尽管脱盐纯化可以移除所有的非必须有机杂质，但它不能有效移除合成中产生微量的提前终止的寡核苷酸杂链，使得纯化效率在95％。