[发明专利]一种MazF介导的FTO酶的检测方法及抑制剂筛选方法

权利要求书

1.一种检测试剂的组合，其特征在于，所述检测试剂的组合中，至少包括RNA探针，MazFmRNA切割酶，T4 PNK酶及环形模板；所述RNA探针中具有m⁶ACA序列，所述环形模板中具有引物结合位点，其扩增链上具有至少一个内切酶识别位点。

2.如权利要求1所述检测试剂的组合，其特征在于，所述RNA探针被检测环境中的FTO酶识别并消除RNA探针中的甲基化，去甲基化的探针被MazF酶识别并且切成为两条短链，A链和B链，所述B链的3’端保留原RNA探针3’的氨基修饰，所述A链的3’端暴露出2′，3′-环磷酸基团，在T4 PNK酶的催化作用下形成3′-羟基末端从而成为环形模板的引物链，所述引物链与环形模板中的识别位点结合引发扩增，扩增形成的扩增链携带内切酶的识别位点从而被剪切成使荧光染料发光的单链DNA。

3.如权利要求1所述检测试剂的组合，其特征在于，所述RNA探针的长度为20～40个碱基，其3’端具有氨基修饰，另外，所述RNA探针的序列中的m⁶ACA位于RNA探针序列全长的中部，距离5’端10～30个碱基处；并且m⁶ACA5’端邻位的碱基具有2′，3′环磷酸基团修饰；优选的，所述RNA探针的长度为28～35个碱基；所述A链的长度为15～20个碱基。

4.如权利要求3所述检测试剂的组合，其特征在于，所述检测试剂的组合中，还具有DNA聚合酶和底物，具体实例为vent(exo-)聚合酶和4种dNTP；

或，所述环形模板扩增后的扩增链中具有一个或多个内切酶的识别位点所述内切酶的一个实例如Nb.BsmI切刻内切酶；所述Nb.BsmI切刻内切酶的识别位点为两个。

5.如权利要求1-4任一项所述检测试剂的组合，其特征在于，所述RNA探针具有如下序列：

GCA AUC GUA UCU UCU CG^mA CAU UUA AAA AA-NH₂；

所述环形模板的序列如下：

TGA CCC ACC CAC CCA CCC ACA GAA TGC TGA CCC ACC CAC CCA CCC ACA GAA TGCTGT CGA GAA GAT ACG ATT GC。

或，所述检测试剂的组合中还具有荧光DNA结合染料，具体的，为SYBR gold。

6.权利要求1-5任一项所述检测试剂的组合在制备RNA去甲基酶检测产品中的应用；优选的，所述RNA去甲基酶为FTO。

7.如权利要求6所述所述检测试剂的组合在制备RNA去甲基酶检测产品中的应用，其特征在于，所述检测产品包括但不限于试剂盒、检测芯片或检测系统中的一种；

其中，试剂盒的一种实施方式中，所述试剂盒中包括权利要求1-5任一项所述检测试剂的组合，还包括缓冲体系、防腐剂。

8.如权利要求7所述所述检测试剂的组合在制备RNA去甲基酶检测产品中的应用，其特征在于，所述缓冲体系包括FTO反应缓冲液、MazF反应缓冲液及T4 PNK反应缓冲液：

进一步的，所述FTO反应缓冲液为HEPES缓冲液，其中还包括α-酮戊二酸、L-抗坏血酸及(NH₄)₂Fe(SO₄)；

进一步的，所述MazF反应缓冲液为磷酸钠缓冲液，其中还具有吐温-20和EDTA；

进一步的，所述T4 PNK反应缓冲液为Tris缓冲液，其中还具有MgCl₂及DTT；

进一步的，所述PG-RCA反应缓冲液为Tris缓冲液，其中还具有(NH₄)₂SO₄、KCl、MgSO₄及Triton X-100。