[发明专利]一种MazF介导的FTO酶的检测方法及抑制剂筛选方法

说明书

本发明涉及一种MazF介导的FTO酶的检测方法及抑制剂筛选方法。RNA去甲基化酶RNA去甲基酶的异常表达与各种人类疾病有关，可作为新的生物标志物和潜在治疗靶点。因此，灵敏的检测RNA去甲基酶并筛选其抑制剂对生物医学研究和临床诊断至关重要。本发明提供了一种利用MazF介导的引物诱导的滚环扩增的无标记方法灵敏检测FTO活性。该方法操作简单，灵敏度高，特异性好，可在单细胞水平检测FTO活性。此外，该方法可用于动力学参数的测定和FTO抑制剂的筛选，有望应用于抗肿瘤活性化合物的开发。

技术领域

本发明属于RNA去甲基酶检测技术领域，具体涉及一种基于MazF介导的滚环扩增(PG-RCA)的无标记荧光方法，及所述检测方法在FTO酶抑制剂筛选领域的应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

RNA去甲基酶的异常表达与各种人类疾病有关，例如，ALKBH5与精子发生缺陷和胶质母细胞瘤干细胞样细胞的致瘤性有关，而FTO与代谢和神经退行性疾病、肥胖、糖尿病、癌症和阿尔茨海默病等密切相关。所以，RNA去甲基酶可作为新的生物标志物和潜在治疗靶点。因此，灵敏的检测RNA去甲基酶并筛选其抑制剂对生物医学研究和临床诊断至关重要。

N⁶甲基腺苷(m⁶A)修饰是腺嘌呤氮-6基团的转录后甲基化，是真核细胞mRNA中最丰富的内部修饰之一。m⁶A修饰在mRNA代谢阶段的各个阶段、长链非编码RNA和miRNA的产生以及包括神经元发育、细胞命运转变、免疫反应和肿瘤发生在内的多种生物过程中起着关键作用。N⁶甲基腺苷(m⁶A)的水平由RNA甲基转移酶(例如，甲基转移酶-3/甲基转移酶-14复合物)和RNA去甲基化酶(例如，脂肪量和肥胖相关蛋白(fat mass and obesity-associatedprotein，FTO)和AlkB同源物(ALKBH5))动态调节，它们可以对核酸碱基添加和去除“甲基”。FTO和ALKBH5都属于Fe²⁺和2-氧戊二酸(2OG)依赖的AlkB双加氧酶家族。RNA去甲基酶的异常表达与各种人类疾病有关。例如，ALKBH5与精子发生缺陷和胶质母细胞瘤干细胞样细胞的致瘤性有关，而FTO与代谢和神经退行性疾病(如肥胖、糖尿病、癌症和阿尔茨海默病)密切相关。RNA去甲基酶可作为新的诊断生物标志物和有希望的治疗靶点。因此，灵敏地检测RNA去甲基酶并筛选其抑制剂对生物医学研究和临床诊断至关重要。

RNA去甲基酶活性测定的传统方法包括放射性检测法、高效液相色谱法(HPLC)、质谱法(MS)。然而，放射性分析需要一个特定的放射性同位素标签，该方法成本高且存在放射性污染的危险。高效液相色谱法(HPLC)和质谱法(MS)依靠直接检测甲基化水平的变化检测RNA去甲基化酶活性，但这些方法涉及费力的制备步骤和大量样品。此外，这些方法受到低吞吐量和低灵敏度的限制，无法实现对微量目标物的灵敏检测。针对上述研究背景，发明人认为，提供一种灵敏检测RNA去甲基酶的方法有助于尽早发现机体中RNA去甲基化酶的变化情况，对于若干疾病的早期诊断和相关活性化合物的筛选具有重要意义。