[发明专利]一种含二硫键多肽人脑利钠肽hBNP的生产与纯化方法及应用

权利要求书

1.一种含二硫键多肽人脑利钠肽hBNP的生产与纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将聚集肽的基因序列、切割标签的基因序列及人脑利钠肽hBNP的基因序列依次连接，形成融合蛋白的基因，将所述融合蛋白的基因导入宿主细胞，得到工程菌；

(2)培养步骤(1)所述工程菌表达所述融合蛋白，然后裂解工程菌，离心取沉淀，得到融合蛋白的聚集体；

(3)将步骤(2)所述融合蛋白的聚集体进行切割，得到中度纯化的含二硫键多肽人脑利钠肽hBNP；

(4)将步骤(3)中所获得的中度纯化人脑利钠肽hBNP，经过2步柱层析，获得高纯度的人脑利钠肽hBNP。

2.根据权利要求1所述的一种含二硫键多肽人脑利钠肽hBNP的生产与纯化方法，其特征在于，步骤(1)中，所述聚集肽包含一个以上的两亲性自组装短肽；所述两亲性自组装短肽为类表面活性剂短肽、两亲性α螺旋短肽中的一种以上；所述类表面活性剂短肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述两亲性α螺旋短肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

3.根据权利要求1所述的一种含二硫键多肽人脑利钠肽hBNP的生产与纯化方法，其特征在于，步骤(1)中，所述切割标签为化学切割位点、酶法切割位点或自切割位点。

4.根据权利要求3所述的一种含二硫键多肽人脑利钠肽hBNP的生产与纯化方法，其特征在于，所述自切割位点为内含肽；

当所述自切割位点为内含肽时，步骤(3)中所述切割，包括：将所述融合蛋白的聚集体分散在缓冲液中，进行切割处理，离心取上清液，得到含人脑利钠肽hBNP的溶液；所述缓冲液的pH值为5.5～6.8，所述切割处理的温度为4～37℃，切割处理的时间为3～48h。

5.根据权利要求4所述的一种含二硫键多肽人脑利钠肽hBNP的生产与纯化方法，其特征在于，所述内含肽为MtuΔI-CM，所述MtuΔI-CM的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。

6.根据权利要求4所述的一种含二硫键多肽人脑利钠肽hBNP的生产与纯化方法，其特征在于，所述内含肽为MtuΔI-CM的突变体，所述MtuΔI-CM的突变体为MtuΔI-CM的m1、m2或m3突变体，所述MtuΔI-CM的m1突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，所述MtuΔI-CM的m2突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，所述MtuΔI-CM的m3突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示。

7.根据权利要求1所述的一种含二硫键多肽人脑利钠肽hBNP的生产与纯化方法，其特征在于，所述多肽人脑利钠肽hBNP含有1个二硫键；所述人脑利钠肽hBNP的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示。

8.根据权利要求1所述的一种含二硫键多肽人脑利钠肽hBNP的生产与纯化方法，其特征在于，其他多肽，其氨基酸长度为20-100个氨基酸，且含有1-3个二硫键；

所述聚集肽的基因序列与切割标签的基因序列之间通过接头连接，所述接头为PT型接头；所述PT型接头的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示。

9.根据权利要求1所述的一种含二硫键多肽人脑利钠肽hBNP的生产与纯化方法，其特征在于，步骤(4)为2步柱层析为标准化的离子交换层析和凝胶排阻层析。

10.由权利要求1～9任一项所述方法制备得到的含二硫键多肽人脑利钠肽hBNP应用于患有休息或轻微活动呼吸困难的急性失代偿心力衰竭患者的静脉治疗。