[发明专利]一种含二硫键多肽人脑利钠肽hBNP的生产与纯化方法及应用

说明书

一种含二硫键多肽人脑利钠肽rhBNP的生产和纯化方法。该方法包括：将聚集肽的基因序列、切割标签的基因序列及人脑利钠肽rhBNP的基因序列依次连接，形成融合蛋白的基因，将所述融合蛋白的基因导入宿主细胞，得到工程菌；培养工程菌表达所述融合蛋白，然后裂解工程菌，离心取沉淀，得到融合蛋白的聚集体；将融合蛋白的聚集体进行切割，得到所述人脑利钠肽rhBNP。本发明纯化得到的人脑利钠肽rhBNP的产量和纯度都很高，特别是在自切割和离心操作后，只需要2步标准化的柱层析即可达到99％以上的纯度。该纯化方法对设备要求低，步骤少，操作简便，生产效率高，成本低，可应用于人脑利钠肽rhBNP的规模化高效生物制备中。

技术领域

本发明属于基因工程领域，更具体地，本发明涉及一种含二硫键多肽人脑利钠肽hBNP的生产和纯化方法。

背景技术

自从1982年FDA批准重组胰岛素用于糖尿病治疗以来，越来越多的蛋白质/多肽在欧盟和美国被批准作为治疗药物(Agyei D等人，2017)。多肽药物因其具有特异性高，疗效好，毒副作用小等特点近年来备受关注，其在医药中应用的研发已广泛涉及抗肿瘤药物、心脑血管药物、疫苗和抗病毒药物，以及诊断试剂盒等多个方面(Leader等人，2008)。在20世纪80年代，几乎所有进入临床开发的肽长度都小于10个氨基酸。随后的十年，得益于肽合成生产技术的改进，进入临床开发中的多肽药物平均肽长度在增加。近十年，开发中的多肽药物长度大于30aa的占比越来越高(M.K.Dunn等人，2018)。同迅速增长的市场需求相比，多肽的生产方法在一定程度上限制了其发展。常规的化学固相合成法在生产超过30个氨基酸的中长多肽时，随着肽段长度增大，合成的成本和难度将大幅增加(Bray等人，2003)。

另一种有效的手段是采用重组方法在宿主细胞内产生多肽。在重组产生多肽的方法中，纯化步骤非常关键。据报道，重组多肽的分离与纯化成本约占其全部生产成本的60％-80％(陈浩等人，2002)。重组多肽的纯化方法包括传统的离子交换层析、疏水性相互作用层析、亲和层析等。离子交换层析和疏水性相互作用层析由于对样品起始条件有一定的要求，通用性和效率不及亲和层析。亲和纯化通常可以获得超过90％的高收率，使其成为目前最常用的重组蛋白纯化方法。常用的亲和纯化技术包括组氨酸标签(his-tag)或谷胱甘肽转移酶标签(GST-tag)与目的多肽的融合表达，为不同目的多肽的生产提供了通用的纯化手段。然而昂贵纯化柱使亲和纯化成本较高，不利于工业领域的应用。

人脑利钠肽(Human Brain Natriuretic Peptide,hBNP)是利钠尿肽系统的一种肽类激素(Lubien E等，2002)，最先由日本学者Sodoh等从猪的体内发现，随后研究发现其主要在心室心肌中合成并分泌，是肾素-血管紧张素-醛固酮系统的天然拮抗剂，参与血压，血容量，水盐平衡的调节，扩张动脉和静脉，降低血管阻力及血浆容量，升高肾小球滤过率，利钠，利尿，降低心脏前后负荷，起到保护心脏的作用。人脑利钠肽hBNP诊断充血性心力衰竭优于A型利钠肽(B.A.Groenning等人，2001)有替代超声心动图的潜力，是超声心动图之外筛选急性心力梗死最好的指标之一(Choy等人，1994)，同时人脑利钠肽hBNP在治疗心力衰竭方面疗效显著，美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration,FDA)批准其作为急性心力衰竭的临床用药。

人脑利钠肽hBNP由32个氨基酸组成，含有一个二硫键，相对分子量为3.5KDa。在心肌细胞内先合成其激素原前体，经裂解去除一个26aa氨基酸信号肽，以108aa的激素前体Pro-BNP形式存在，当心肌细胞受到刺激时，在活化酶的作用下裂解为无活性的直线多肽和和有活性的含32aa的C端活性多肽片段-BNP(E.M.Vilela等人,2015)。