[发明专利]基因敲除用报告载体和载体系统及应用

权利要求书

1.一种基因敲除用的报告载体，其特征在于，该报告载体含有启动子、荧光蛋白表达元件与位于启动子和荧光蛋白表达元件之间的sgRNA1靶序列-转录终止序列-sgRNA2靶序列元件。

2.根据权利要求1所述的报告载体，其中，所述启动子为CMV启动子、EF1a启动子和CAG启动子中的至少一种；

和/或，所述转录终止序列为PolyA和/或WPRE；

和/或，所述荧光蛋白表达元件含有IRES序列和荧光蛋白编码基因。

3.根据权利要求2所述的报告载体，其中，所述荧光蛋白编码基因为GFP基因、RFP基因、Mcherry基因和YFP基因的至少一种。

4.根据权利要求3述的报告载体，其中，所述报告载体含有CMV启动子、IRES-GFP元件与位于CMV启动子和IRES-GFP元件之间的sgRNA1靶序列-PolyA-sgRNA2靶序列元件。

5.一种基因敲除用的载体系统，其特征在于，该载体系统包括表达载体和报告载体，所述表达载体能够表达Cas9、sgRNA1和sgRNA2；

所述报告载体为权利要求1-4中任意一项所述的报告载体。

6.根据权利要求5所述的载体系统，其中，所述表达载体包括sgRNA1表达载体、sgRNA2表达载体和Cas9表达载体。

7.权利要求5或6所述的载体系统在建立基因敲除细胞株中的应用。

8.一种建立基因敲除纯合子的方法，其特征在于，该方法包括：

(i)细胞转染：将权利要求5或6所述的载体系统转染目标细胞，得到转染后的目标细胞；

(ii)阳性单克隆筛选：将所述转染后的目标细胞进行阳性单克隆筛选，得到阳性单克隆；

(iii)筛选纯合子：将所述阳性单克隆进行PCR鉴定，得到基因敲除纯合子。

9.根据权利要求8所述的方法，其中，步骤(ii)中，所述阳性单克隆筛选包括：将所述转染后的目标阳性细胞用流式细胞仪进行阳性单克隆筛选。

10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述目标细胞为A549细胞或293T细胞；

和/或，所述敲除目标基因为STAT1基因。