[发明专利]基因敲除用报告载体和载体系统及应用

说明书

本发明涉及分子生物学及遗传学技术领域，具体涉及一种基因敲除用报告载体和载体系统及应用。本发明的基因敲除用的报告载体含有启动子、荧光蛋白表达元件与位于启动子和荧光蛋白表达元件之间的sgRNA1靶序列‑转录终止序列‑sgRNA2靶序列元件。本发明的载体系统的制备方法简单、筛选方便，快速建立基因敲除纯合子的方法通过非同源重组的方法来实现基因敲除的目的，可高效地获得突变纯合子，且筛选效率高，操作简单，可获得大量纯合子细胞，且可进行大片段的敲除，降低经济成本及时间成本。

技术领域

本发明涉及分子生物学及遗传学技术领域，具体涉及一种基因敲除用报告载体和载体系统及应用。

背景技术

基因敲除技术是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。

目前CRISPR/Cas9有个极大的优势就是在DNA的特定位置制造双链切口，来激活细胞的DNA修复，进而实现基因定点InDel突变、小片段的缺失、编码基因和非编码基因(lncRNA、microRNA)的靶向基因敲除。而本方法不仅仅可以实现上述基因编辑成果，还可实现大片段的基因敲除。

使用CRISPR/Cas9技术进行基因敲除时，sgRNA的敲除活性对敲除效率有较大的影响。此外，为了获得基因敲除的纯合子细胞(以下简称“纯合子”)，还需要对经过基因敲除的细胞进行筛选。目前，常用的筛选方法之一是使用含有报告基因的报告载体进行初步筛选，例如PX458载体。但是，现有的报告载体，只能筛选出转染阳性的细胞，不能反映sgRNA是否有活性，导致获得目的细胞效率低，工作量、时间长。

CN105950656A公开了一种快速获得基因敲除细胞株的方法，使用了SSA-hRluc-psiCHECK-MSTN质粒对敲除效率进行验证，该质粒上含有一个萤火虫荧光素酶表达基因和一个被目的基因隔断的不表达海肾荧光素酶表达基因，对目的基因进行有效切割之后，海肾荧光素酶表达基因发生同源重组使得海肾荧光素酶高效表达，通过表达量即可鉴定敲除效率。但是，在常见的肿瘤细胞系、终末分化的细胞等细胞内的SSA修复效率极低，远小于非同源重组修复效率，而细胞基因组被切割后主要采用的是非同源重组修复机制，因此SSA方法并不能真实反映细胞染色体DNA修复的真实情况，所以SSA筛选纯合子的效率也相对较低，此外，SSA重组方法中，仅有1个sgRNA有效，其转染的细胞即可表达荧光，不能反映两个sgRNA同时发挥作用的情况，不利于用于对基因进行片段删除的基因编辑的筛选工作。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术存在的筛选效率低，筛选细胞不能真实反应CRISPR/Cas9活性的问题，提供一种基因敲除用报告载体、载体系统、应用及建立基因敲除纯合子的方法。本发明所述载体系统中所使用的sgRNA1、sgRNA2有活性时，报告载体中的荧光蛋白表达元件才能有效表达，所述载体系统的制备方法简单、筛选方便，所述的快速建立基因敲除纯合子的方法通过非同源重组的方法来实现基因敲除的目的，可高效地获得突变纯合子，且筛选效率高，操作简单，可获得大量纯合子细胞，且可进行大片段的敲除，降低经济成本及时间成本。

为了实现上述目的，本发明第一方面提供一种基因敲除用的报告载体，该报告载体含有启动子、荧光蛋白表达元件与位于启动子和荧光蛋白表达元件之间的sgRNA1靶序列-转录终止序列-sgRNA2靶序列元件。

本发明第二方面提供一种载体系统，该载体系统包括表达载体和报告载体，所述表达载体能够表达Cas9、sgRNA1和sgRNA2；

所述报告载体为如前所述的报告载体。

本发明第三方面提供一种如前所述的载体系统在建立基因敲除细胞株中的应用。

本发明第四方面提供一种建立基因敲除纯合子的方法，所述方法包括：