[发明专利]用于辅酶Ⅰ含量检测的高效液相色谱分析方法及其应用

说明书

本发明公开用于辅酶Ⅰ含量检测的高效液相色谱分析方法，包括以下步骤：S1、采用反向色谱柱，以碳十八烷基键合硅胶为填充剂；S2、流动相为甲醇，10％四丁基氢氧化铵，磷酸，磷酸二氢钾等4种物质组成的混合溶剂。甲溶液组成的体积比例为甲醇5％，0.05M 10％四丁基氢氧化铵‑0.05M磷酸二氢钾水溶液(磷酸调至pH4.0‑5.0)95％；乙溶液组成的体积比例为甲醇30％，0.05M 10％四丁基氢氧化铵‑0.05M磷酸二氢钾水溶液(磷酸调至pH4.0‑5.0)70％。S3、检测波长260nm，柱温25℃，流速1ml/min，进样体积20ul。本发明检测方法简便，与传统的醇脱氢酶测定方法相比，以指纹图谱形式呈现，不仅具有直观性，而且具有专属性强、灵敏度高、稳定性好、测定准确率高等技术优点。

技术领域

本发明涉及液相色谱测定分析技术领域，具体涉及一种用于辅酶Ⅰ含量检测的高效液相色谱分析方法及其在测定酵母细胞热提取液中辅酶Ⅰ含量方面的应用。

背景技术

传统的醇脱氢酶测定方法，不具有直观性，而且专属性较弱、灵敏度较低、稳定性较差、特别是提取溶液测定中存在干扰物质多、准确性较低等技术缺点。而目前现有的辅酶Ⅰ液相分析方法^[1-2]并不适合测定酵母细胞热提取液中辅酶Ⅰ，辅酶Ⅰ与杂质分离度差。因此方法需要进行改进。

参考文献：

[1]李会品,赵谋明,俞志敏,等.rp-hplc法同时测定酿酒酵母胞内磷酸腺苷和辅酶Ⅰ[J].食品与生物技术学报,2012.

[2]邓卓燕.高效液相色谱法同时测定注射用复合辅酶中辅酶A和辅酶I的含量[J].海峡药学,2016,28(3):2。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的缺陷和不足，提供一种用于辅酶Ⅰ含量检测的高效液相色谱分析方法及其在测定酵母细胞热提取液中辅酶Ⅰ含量方面的应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种用于辅酶Ⅰ含量检测的高效液相色谱分析方法，其创新点在于，包括以下步骤：

S1、采用反向色谱柱，以碳十八烷基键合硅胶为填充剂；

S2、流动相为甲醇，10％四丁基氢氧化铵，磷酸，磷酸二氢钾等四种物质组成的混合溶剂。甲溶液组成的体积比例为甲醇5％，0.05M 10％四丁基氢氧化铵-0.05M磷酸二氢钾水溶液(磷酸调至pH4.0-5.0)95％。乙溶液组成的体积比例为甲醇30％，0.05M 10％四丁基氢氧化铵-0.05M磷酸二氢钾水溶液(磷酸调至pH4.0-5.0)70％；

S3、检测波长260nm，柱温25℃，流速1ml/min，进样体积20ul。

一种高效液相色谱分析方法在测定酵母细胞热提取液中辅酶Ⅰ含量方面的应用，其创新点在于：可以同时测定八种辅酶Ⅰ及其相关性物质，分别为氧化型辅酶Ⅰ(NAD+)、还原型(NADH)、烟酰胺(N)、烟酰胺核苷(NR)、烟酰胺单核苷酸(NMN)、腺嘌呤(A)、腺嘌呤核苷(AR)、腺嘌呤单核苷酸(AMP)。

本发明有益效果为：本发明检测方法简便，与传统的醇脱氢酶测定方法相比，以指纹图谱形式呈现，不仅具有直观性，而且专属性强、灵敏度高、稳定性好、测定准确等技术优点。

附图说明

图1为实施例1的色谱图；

图2为实施例3的色谱图；

图3为实施例4的色谱图；

图4为实施例5和实施例6的色谱图；

图5为实施例7的色谱图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步的说明。