[发明专利]可溶性幽门螺杆菌疫苗重组抗原UreA的重组载体、表达纯化方法及其用途

权利要求书

1.可溶性幽门螺杆菌重组抗原UreA的重组载体，其特征在于：所述的重组载体是将核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的UreA基因导入表达载体中构建而得的；所述的表达载体为pET28a+。

2.包含权利要求1所述的可溶性幽门螺杆菌重组抗原UreA的重组载体的宿主细胞。

3.根据权利要求2所述的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞为 E. coliBL21DE3。

4.权利要求1中所述的可溶性幽门螺杆菌重组抗原UreA的表达纯化方法，包括以下步骤：

a、构建质粒并原核表达

将核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的目的基因连接在表达载体质粒中，构成重组载体，转化至外源蛋白表达的宿主菌中进行诱导表达；所述的表达载体为pET28a+；

b、菌体破碎、离心

收集表达后的菌体用破菌液重悬混匀，冰水浴后采用高压均质仪破菌，离心，收集上清液；

c、Ni柱亲和纯化

将收集到的上清液进行Ni亲和填料纯化，使用A1液、A2液平衡层析柱，使用B液洗脱；

所述A1液组成为：pH8.0-9.0的20-50mM Na ₂CO ₃-NaHCO ₃缓冲液，0.3-0.5M NaCl，0.5-1.5M尿素；A2液组成为：pH8.0-9.0的20-50mM Na ₂CO ₃-NaHCO ₃缓冲液，0.3-0.5MNaCl；B液组成为pH8.0-9.0的20-50mM Na ₂CO ₃-NaHCO ₃缓冲液，0.3-0.5 M NaCl，0.5-1M咪唑；

d、脱盐纯化

对步骤c洗脱的蛋白质采用G25凝胶填料进行纯化，使用C液对目的蛋白进行脱盐纯化，得到重组可溶性幽门螺杆菌重组抗原UreA；所述C液的组成为pH8.0- 9.0的20-50 mM Na₂CO ₃-NaHCO ₃缓冲液，0.135M NaCl。

5.根据权利要求4所述的可溶性幽门螺杆菌重组抗原UreA的表达纯化方法，其特征在于：步骤a所述的幽门螺杆菌UreA的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示。

6.根据权利要求4所述的可溶性幽门螺杆菌重组抗原UreA的表达纯化方法，其特征在于：步骤a所述诱导表达的条件为：在14-16℃、180-240rpm下，使用0.3-0.5mM IPTG诱导表达12-18h。

7.根据权利要求4所述的可溶性幽门螺杆菌重组抗原UreA的表达纯化方法，其特征在于：步骤b所述破菌液由20-50 mM Na ₂CO ₃-NaHCO ₃缓冲液、0.3-0.5 M NaCl和0.5-1.5M尿素、2mM MgCl ₂、300-500 U核酸酶组成，pH值为8.0- 9.0。

8.权利要求4-7任一项所述的表达纯化方法制备得到的重组可溶性幽门螺杆菌重组抗原UreA。

9.权利要求1所述的重组载体、权利要求2或3所述的宿主细胞、权利要求8所述的重组可溶性幽门螺杆菌重组抗原UreA在制备幽门螺杆菌疫苗中的用途。