[发明专利]可溶性幽门螺杆菌疫苗重组抗原UreA的重组载体、表达纯化方法及其用途

说明书

本发明属于生物技术及生物制药技术领域，涉及一种幽门螺杆菌重组抗原蛋白UreA。针对目前重组蛋白UreA一般以包涵体或融合蛋白的形式表达、纯化难度大、难以大量获得可溶性UreA蛋白的问题，本发明提供了一种可单独高效表达可溶性UreA蛋白的重组载体、宿主细胞、表达纯化方法。本发明将密码子优化后的UreA核苷酸序列导入表达载体pET28a(+)中，经诱导表达，可得到可溶性的重组表达蛋白UreA，并且表达量高，获得的重组蛋白纯度高。本发明首次获得了单独高效表达的可溶性重组UreA，并且工艺简单，重复性好，蛋白表达量占大肠杆菌蛋白总量的22％，且经纯化后蛋白纯度高于98％，为后续对UreA进行更有效和深入的研究提供了基础。

技术领域

本发明属于生物技术及生物制药技术领域，涉及一种重组抗原蛋白，具体涉及一种表达可溶性的幽门螺杆菌重组抗原蛋白UreA的重组载体、表达纯化方法及其用途。

背景技术

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，以下简称Hp)是一种寄生于人体胃肠道的条件致病菌，属于革兰氏阴性菌，被公认为与多种消化道疾病，特别是消化性溃疡、慢性胃炎、胃癌及黏膜相关淋巴样组织淋巴瘤等的发生有着非常密切的联系。幽门螺杆菌的感染严重危害着人们的健康，而临床上针对于幽门螺杆菌感染的传统治疗方法常用“三联”、“四联”疗法，虽然在一定程度上可以治愈感染，但治疗过程中仍存在着抗生素用药量多，治疗费用昂贵、复发率居高不下等亟待解决的问题。

经过数十年的科学研究，已有大量的实验证明，免疫接种可以有效预防甚至治疗Hp感染所带来的一系列疾病。1993年Czinn等用猫胃螺旋杆菌裂解物口服免疫小鼠诱导黏膜产生高水平的分泌性IgA(SIgA)，同时发现还可以预防猫胃螺旋杆菌的再感染，首次证实了疫苗的保护作用，随后针对幽门螺杆菌的疫苗被越来越多的学者开始研究。因此疫苗接种有望成为未来预防和治疗幽门螺杆菌感染最有效也是最有前景的手段之一。

随着分子生物学的不断发展，基因工程疫苗的研究成为了目前的研究热点。Hp存在着多种抗原成分，而Hp感染和致病的作用因子可以分为定植因子和毒性因子两类，其中尿素酶既能影响Hp在体内的定植，又是重要的毒性分子。Hp尿素酶能通过分解尿素产生的氨有效抵抗胃酸杀伤，同时在Hp中含量丰富，在菌体表面广泛表达并高度保守，具有相对分子质量大、可形成颗粒状结构等特点，是Hp亚单位疫苗中最有希望的保护性抗原之一。

尿素酶的分子量为550kDa，其单体由UreA、UreB两个亚单位构成，两个亚单位在尿素酶中的比例为1:1。尿素酶的完整体结构由12聚体构成，分子量大，结构复杂，重组表达完整尿素酶工艺复杂、难度较大，而UreA、UreB作为亚单位抗原已经被充分证实其免疫效果，且工艺更简单，因此，UreA、UreB作为亚单位抗原，研究其在幽门螺杆菌疫苗中的作用更为简单。

但现有研究多集中在对UreB抗原的研究中，由于UreA抗原可溶表达难度大、纯化难度大，关于UreA抗原的研究相对较落后。

现有研究中，Michetti,Pierre等人曾经以原核表达载体pEV40重组表达UreA，经包涵体复性获得UreA亚单位抗原，以霍乱毒素为佐剂灌胃免疫BalB/c小鼠，获得较高保护率，说明UreA亚单位疫苗具有极大的免疫潜力。而目前针对UreA重组抗原的克隆表达还存在许多需要解决的问题，尿素酶蛋白结构疏水性强，重组大肠杆菌多为包涵体或融合蛋白形式表达，且表达量较低，一般不超过20％。并且，包涵体表达的蛋白需要经过多个步骤的复性，制作工艺复杂、成本高且获得的抗原活性较低；而融合表达的蛋白也存在着结构复杂，纯化困难等问题。除此之外，UreA蛋白分子较小，结构呈哑铃状，极易与其他小分子蛋白或核酸杂质发生裹缠，导致纯化难度大，其纯化存在很大困难。

目前，UreA重组抗原的表达多以包涵体或融合蛋白形式表达，还未见有单独高效表达UreA重组抗原的表达方法，表达后的UreA蛋白纯化难度也很大，急需开发一种能够单独高效表达UreA重组抗原并且能简单纯化该蛋白的方法。

发明内容