[发明专利]泛素突变体及其制备方法和用途

权利要求书

1.一种泛素突变体，与野生型泛素相比，在所述泛素突变体的氨基酸序列中：(1)至少一个位于野生型泛素的表面位点的氨基酸被替换为非天然氨基酸；并且(2)1至7个参与泛素化连接的氨基酸被修饰或突变从而丧失参与泛素化连接的能力；其中所述野生型泛素的氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示。

2.根据权利要求1所述的泛素突变体，其中与野生型泛素相比，全部赖氨酸被替换为不参与非线性泛素化连接的氨基酸，例如精氨酸。

3.根据权利要求1或2所述的泛素突变体，其中所述表面位点选自下组：K6、T9、G10、K11、T14、E16、V17、E18、S20、D21、T22、E24、N25、K27、A28、K29、Q31、D32、K33、E34、G35、P37、D39、Q40、R42、A46、Q49、E51、D52、R54、T55、S57、D58、Y59、N60、Q62、R63、E64、S65和T66；

优选选自N10、K29、R42、A46、R54和N60；

更优选选自A46或R54，例如R54。

4.根据前述任一项权利要求所述的泛素突变体，其中所述非天然氨基酸包含参与生物正交反应的基团，优选地所述生物正交反应选自下组：点击化学、光交联、光敏感和糖基化。

5.根据权利要求4所述的泛素突变体，其中所述非天然氨基酸包含选自下组的官能团：叠氮基团、炔基、酮基、巯基、醛基、酰胺基、烯基、硝基、磷酸根、磺酸根和双吖丙啶基团。

6.根据权利要求4或5所述的泛素突变体，其中所述非天然氨基酸选自下组：3-(6-乙酰萘-2-基氨基)-2-氨基丙酸(Anap)、(S)-1-羧基-3-(7-羟基-2-氧代-2H-色烯-4-基)丙-1-胺(CouAA)、3-(5-(二甲氨基)萘-1-磺酰胺)丙酸(丹磺酰丙氨酸(Dansylalanine))、Nε-对叠氮基苄氧基羰基赖氨酸(PABK)、炔丙基-L-赖氨酸(PrK)、Nε-(1-甲基环丙-2-烯甲酰胺基)赖氨酸(CpK)、Nε-丙烯酰赖氨酸(AcrK)、Nε-(环辛-2-炔-1-基氧基)羰基)L-赖氨酸(CoK)、双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲醇赖氨酸(BCNK)、反式环辛基-2-烯赖氨酸(2'-TCOK)、反式环辛基-4-烯赖氨酸(4'-TCOK)、二氧-TCO赖氨酸(DOTCOK)、3-(2-环丁烯-1-基)丙酸(CbK)、Nε-5-降冰片烯-2-基氧羰基-L-赖氨酸(NBOK)、环辛炔赖氨酸(SCOK)、5-降冰片烯-2-醇酪氨酸(NOR)、环辛-2-醇酪氨酸(COY)、(E)-2-(环辛-4-烯-1-基氧基)乙醇酪氨酸(DS1/2)、叠氮高丙氨酸(AHA)、高丙炔基甘氨酸(HPG)、叠氮亮氨酸(ANL)、Nε-2-叠氮乙氧羰基-L-赖氨酸(NAEK)、氟硫酸盐-L-酪氨酸、氟磺酰氧基苯甲酰赖氨酸或((3-(3-甲基-3H-二氮杂环丙烯-3-基)丙氨基)羰基)-Nε-L-赖氨酸，或其他带有叠氮基团的非天然氨基酸。

7.分离的核酸分子，其包含编码权利要求1-6任一项所述的泛素突变体的核苷酸序列。

8.权利要求7的分离的核酸分子，所述核苷酸序列中编码所述非天然氨基酸的密码子为不编码20种天然氨基酸的密码子；例如所述编码非天然氨基酸的密码子为无义三联密码子、四联密码子或在目标宿主中冗余的稀有密码子；优选所述编码非天然氨基酸的密码子为选自TAG、TGA和TAA的无义三联密码子。

9.表达载体，其包含根据权利要求7或8所述的分离的核酸分子。

10.宿主细胞，其包含根据权利要求7或8所述的核酸分子或根据权利要求9所述的表达载体。