[发明专利]泛素突变体及其制备方法和用途

说明书

本发明提供含有非天然氨基酸的泛素突变体，其中至少一个参与泛素化连接的氨基酸经修饰或突变从而不参与泛素化连接。还提供用于制备所述泛素突变体的方法、分离的核酸分子、表达载体和宿主细胞，以及所述泛素突变体的用途。

技术领域

本发明涉及蛋白质翻译后修饰的领域，具体而言涉及蛋白质的泛素化修饰的检测。本发明提供含有非天然氨基酸的泛素突变体，特别是含有非天然氨基酸的KR突变体，以及使用该泛素突变体来标记具有泛素化修饰(例如线性泛素化修饰)的蛋白质的方法。本发明还提供用于检测和/或富集蛋白质的方法，所述蛋白质带有包含所述泛素突变体的泛素化修饰。本发明还提供用于制备所述泛素突变体的方法、编码所述泛素突变体的核酸分子、表达载体、包含所述表达载体的细胞，以及包含这些的试剂盒。

背景技术

蛋白质的泛素化修饰为一种翻译后修饰。作为调节各种细胞生物功能的过程，已有大量针对泛素化修饰的研究。目前报道的多聚泛素化修饰主要有8种不同类型的泛素连接方式，其中7种涉及通过泛素链内7个赖氨酸(K)之一与另一泛素C末端甘氨酸(G)的连接。这7个赖氨酸分别位于野生型泛素的K6、K11、K27、K29、K33、K48和K63位。第八种在2006年由日本Kazuhiro Iwai教授首次发现，其连接方式是通过泛素的N末端甲硫氨酸(M1)与另一泛素C末端的甘氨酸的羧基相连，因此也称为M1连接。这种通过泛素首尾相连形成的泛素化修饰也被称为线性泛素化修饰。

细胞内的线性泛素化水平受到线性泛素组装复合物(LUBAC，由HOIP、HOIL-1和SHARPIN组成)和特异性去泛素酶OTULIN(也称为FAM105B或Gumby)的紧密调控。研究表明，这种特殊的翻译后修饰在生理活动中扮演十分重要的角色，例如调控血管生成，参与炎症，抗入侵病原体的选择性自噬以及先天免疫相关的信号通路等。异常线性泛素化是一系列免疫功能障碍和炎症性疾病的原因，因此近年来对线性泛素化修饰的研究日益增多。

然而，内源线性泛素化与其他泛素化不同，其丰度很低，无法通过质谱等技术直接检测。富集泛素化修饰底物的传统方法在鉴定线性泛素化方面显得十分乏力。因此迄今为止，仅有为数不多的线性泛素修饰底物得以鉴定和分析，例如NF-κb复合物NEMO(Tokunaga,F.et al.Nat Cell Biol,2009,11:123-132.)、炎症小体适配器蛋白ASC(M.A.Rodgers etal.J Exp Med,2014,211:1333-1347.)、坏死中介物质RIPK1(R.Wei et al.Genes Dev,2017,31:1162-1176.)以及干扰素信号STAT1(Y.Zuo et al..Nat Commun,2020,11:1146.)等。即使是关于已知的LUBAC(由HOIP、HOIL-1和SHARPIN组成)和特异性去泛素酶OTULIN的分子机制和复合物结构等，也仍具有争议和未解之处。

目前关于泛素化底物的规模化研究方法主要有三类，包括在肽段层面使用针对泛素残基的特异性抗体的免疫纯化方法、标签富集法以及在蛋白层面基于UBD(Ubiquitin-binding domains)结构域的亲和纯化方法。

一方面，目前的商业化抗体对线性泛素链的亲和力较差，无法实现底物的高效富集(M.L.Matsumoto et al.,J Mol Biol.,2012,418:134-144.)，特异性针对线性泛素化的抗体多数不适用于免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation，IP)富集底物，只适用于潜在线性泛素化底物的确认。另一方面，若使用在泛素两端加蛋白标签的传统方法，N/C末端添加的标签会影响泛素首尾相连的线性连接，因而也不可行。利用泛素结合结构域进行拖拽(pull-down)等方法效能较低。总之，常用的方法均不能满足线性泛素化底物的富集与鉴定需求(Rahighi,S.et al.Cell,2009,136:1098-1109.)。因此，迫切需要发展新的技术方法对线性泛素化底物进行富集和鉴定，特别是在接近生理条件下建立高效富集线性泛素化底物的方法，进行体内的定位与跟踪。