[发明专利]t-PA纯化方法

权利要求书

1.一种t-PA纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：

获得含有t-PA与t-PA抑制剂形成的非共价复合物的上样液；及

将所述上样液进行赖氨酸亲和层析，制得纯化的t-PA。

2.根据权利要求1所述的t-PA纯化方法，其特征在于，所述t-PA抑制剂选自α-抗胰蛋白酶、牛胰蛋白酶抑制剂、纤溶酶原激活剂抑制剂-1、纤溶酶原激活剂抑制剂-2、纤溶酶原激活剂抑制剂-3、神经源性丝氨酸蛋白酶抑制剂和胶质细胞源性连接蛋白中的至少一种。

3.根据权利要求1或2所述的t-PA纯化方法，其特征在于，制备所述非共价复合物的步骤包括：

构建共表达t-PA和t-PA抑制剂的表达载体；及

将所述表达载体转染至宿主细胞中表达，制备所述非共价复合物。

4.根据权利要求3所述的t-PA纯化方法，其特征在于，构建所述表达载体的步骤包括：将插入编码t-PA的核苷酸序列的表达载体和插入编码t-PA抑制剂的核苷酸序列的表达载体连接成双表达框表达载体。

5.根据权利要求3所述的t-PA纯化方法，其特征在于，所述宿主细胞为哺乳动物细胞。

6.根据权利要求5所述的t-PA纯化方法，其特征在于，所述宿主细胞为中国仓鼠卵巢细胞。

7.根据要求1～2和4～6中任一项所述的t-PA纯化方法，其特征在于，所述上样液中t-PA的浓度大于200μg/mL。

8.根据要求1～7任一项所述的t-PA纯化方法，其特征在于，所述上样液进行赖氨酸亲和层析的步骤包括：

上样：采用平衡液平衡赖氨酸亲和层析柱后上样；

淋洗：上样结束后，采用淋洗液淋洗赖氨酸亲和层析柱；

洗脱：在淋洗结束后，采用洗脱液洗脱赖氨酸亲和层析柱，收集洗脱流出液。

9.根据权利要求8所述的t-PA纯化方法，其特征在于，所述平衡液包括pH为5.0～8.0的缓冲溶液；所述淋洗液包括含有0.5mol/L～2.0mol/L的钠盐或0.5mol/L～2.0mol/L的钾盐的pH为5.0～8.0的缓冲溶液；所述洗脱液包括含有0.1mol/L～2mol/L的具有赖氨酸结合位点的物质的pH为3.5～7.5的缓冲溶液，所述具有赖氨酸结合位点的物质选自精氨酸、赖氨酸和ε-氨基己酸中至少一种。

10.根据权利要求9所述的t-PA纯化方法，其特征在于，所述洗脱液包括：0.1mol/L～2mol/L的具有赖氨酸结合位点的物质、40mmol/L～60mmol/L的NaH₂PO₄和0％(w/v)～0.02％(w/v)的Tween-80，所述具有赖氨酸结合位点物质选自精氨酸、赖氨酸和ε-氨基己酸中的一种。

11.根据权利要求9或10所述的t-PA纯化方法，其特征在于，所述淋洗液包括：0.5mol/L～2mol/L的NaCl、40mmol/L～60mmol/L的NaH₂PO₄和0％(w/v)～0.02％(w/v)的Tween-80。

12.根据权利要求9或10所述的t-PA纯化方法，其特征在于，所述平衡液包括：40mmol/L～60mmol/L的NaH₂PO₄和0％(w/v)～0.02％(w/v)的Tween-80。