[发明专利]t-PA纯化方法

说明书

本发明涉及一种t‑PA纯化方法。该t‑PA纯化方法包括步骤：获得含有t‑PA与t‑PA抑制剂形成的非共价复合物的上样液；及将上样液进行赖氨酸亲和层析，制得纯化的t‑PA。该t‑PA纯化方法，通过将t‑PA与t‑PA抑制剂形成的非共价复合物，和赖氨酸亲和层析的结合使用，能够实现t‑PA的一步层析纯化，并且得到纯度高的t‑PA。一步纯化有利于提高纯化的回收率，以及便于工业化生产，降低生产成本。

技术领域

本发明涉及蛋白纯化领域，特别是涉及一种t-PA纯化方法。

背景技术

机体中的纤溶酶原激活剂有两种，分别是组织型纤溶酶原激活剂t-PA(Tissueplasminogen activator)与尿激酶型纤溶酶原激活剂u-PA(Urokinase plasminogenactivator)。它们均具有激活纤溶酶原成为纤溶酶的特性，因而可被应用于因血栓引起的多种疾病的治疗。其中u-PA由于具有较强的非特异性，既能激活血液凝块中的纤溶酶原，也可激活血液循环中流动的纤溶酶原，有较高的溶血风险。另经研究表明，动物细胞高表达的u-PA其治疗效果不如t-PA。相比之下，t-PA具有较高特异性，只选择性激活血液凝块中的纤溶酶原，不会产生溶血风险，治疗效果也更为理想，故t-PA成为了临床上重要的溶栓治疗药物。

由于t-PA为静脉注射给药，其临床用量比一般生物蛋白要大得多，用于急性心肌梗死的常规剂量为1.25毫克/千克体重，按成年人平均体重50千克一天给药一次计算，给药剂量为62.5毫克/人/天。然而正常细胞能产生的t-PA的量远不能满足临床使用需要，人黑色素瘤细胞的t-PA表达量也只有1.4毫克/升，高密度灌流培养的上皮细胞的t-PA表达量为5毫克/升～10毫克/升，传统的重组CHO细胞(Chinese hamster ovary cells)的t-PA表达量能达120毫克/升。要纯化得到成人一剂量的t-PA，在理想的回收率无损失的情况下，需要人黑色素瘤细胞发酵液44.6升，或上皮细胞发酵液6.25升，或传统的重组CHO细胞发酵液521毫升，可见需要的发酵液量很大。但实际上不可能达到回收率无损失的情况，所需要的发酵液更多，提高t-PA的生产和纯化效率则很有必要。

而目前t-PA的纯化工艺一般需要3～4步才能实现90％以上的纯度，常见的t-PA纯化策略有：经过蓝色琼脂糖凝胶层析、赖氨酸亲和层析和凝胶过滤层析三步层析，或经过阳离子交换层析、赖氨酸亲和层析和疏水层析三步层析，或经过锌离子鳌合层析、伴刀豆球蛋白A亲和层析和凝胶过滤层析三步层析等。这些t-PA的纯化工艺复杂，步骤繁琐，不利于提高纯化回收率及工业化生产。

发明内容

基于此，有必要提供一种t-PA纯化方法，以简便快速地获得大量高纯度的t-PA，降低工业化生产成本。

一种t-PA纯化方法，包括以下步骤：

获得含有t-PA与t-PA抑制剂形成的非共价复合物的上样液；及将上样液进行赖氨酸亲和层析，制得纯化的t-PA。

上述的t-PA纯化方法，通过将t-PA与t-PA抑制剂形成的非共价复合物，和赖氨酸亲和层析的结合使用，能够实现t-PA的一步层析纯化，并且得到纯度高的t-PA。一步纯化有利于提高纯化的回收率，以及便于工业化生产，降低生产成本。

在其中一个实施例中，t-PA抑制剂选自α-抗胰蛋白酶、牛胰蛋白酶抑制剂、纤溶酶原激活剂抑制剂-1、纤溶酶原激活剂抑制剂-2、纤溶酶原激活剂抑制剂-3、神经源性丝氨酸蛋白酶抑制剂和胶质细胞源性连接蛋白中的至少一种。

在其中一个实施例中，制备上述非共价复合物的步骤包括：构建共表达t-PA和t-PA抑制剂的表达载体；及将该表达载体转染至宿主细胞中表达，制备上述非共价复合物。

在其中一个实施例中，构建上述表达载体的步骤包括：将插入编码t-PA的核苷酸序列的表达载体和插入编码t-PA抑制剂的核苷酸序列的表达载体连接成双表达框表达载体。