[发明专利]一种外泌体ALK融合蛋白磁免疫化学发光检测试剂盒

说明书

本发明公开了一种外泌体ALK融合蛋白磁免疫化学发光检测试剂盒。所述检测试剂盒包括：磁珠悬液、ALK蛋白抗体工作液、发光激发液、标准品、稀释液、洗涤液；所述磁珠悬液中的磁珠微球包被有外泌体CD81/CD63抗体；所述ALK蛋白抗体工作液含有吖啶酯标记的ALK蛋白抗体；所述ALK蛋白抗体为ALK蛋白胞外肽段抗体1和ALK蛋白胞内肽段抗体2的组合，其中，胞外肽段抗体1与胞内肽段抗体2的比例为1～10：1，优选为4～6：1。本发明优化筛选的ALK蛋白抗组合体可特异性识别外泌体膜表面所有ALK蛋白，实现了肿瘤患者血浆中微量ALK融合蛋白的超敏检测。

技术领域

本发明属于外泌体检测技术领域，具体涉及一种外泌体ALK融合蛋白磁免疫化学发光检测试剂盒。

背景技术

外泌体(exosome)是活细胞释放到细胞外的微小囊泡，直径在30-160 nm。外泌体含有细胞特异性的蛋白质、脂质和遗传物质可被运送到其他的细胞，从而改变它们的功能和生理特征。目前，越来越多的科学家们也对肿瘤细胞分泌的外泌体越来越感兴趣。血液循环中的肿瘤细胞（CTC）要到达新的位点，肿瘤细胞分泌的外泌体发挥的作用至关重要。肿瘤外泌体是肿瘤细胞与其微环境之间相互作用的重要介质，它们通过共享遗传信息或功能蛋白来调节细胞行为。肿瘤外泌体参与上皮间质转化（EMT）、肿瘤血管生成、肿瘤转移和放化疗抗性的调节。

许多研究表明，癌症患者血浆中外泌体浓度明显升高，而外泌体可表达特异性的蛋白质和RNA、DNA等，具有肿瘤生物标志物的潜能，因而被广泛应用于肿瘤液体活检中，与TCT、ctDNA一起作为液体活检的重要项目。在前列腺癌、非小细胞肺癌、鼻咽癌、结肠癌、肝癌等肿瘤中，也都发现各具特征的外泌体成分，特别是外泌体蛋白，都具有潜在的诊断价值。

ALK最早是在间变性大细胞淋巴瘤（ALCL）的一个亚型中被发现的，因此定名为间变性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase，ALK）。ALK融合基因的产物是分子量为80KD的融合肿瘤蛋白。ALK基因融合突变是非小细胞肺癌（NSCLC）常见的一种驱动基因，中国非小细胞肺腺癌中ALK融合突变阳性的比例为5.3%。目前已经上市的ALK TKI包括克唑替尼（Crizotinib）、塞瑞替尼（Ceritinib）、阿来替尼（Alectinib）、布加替尼（Brigatinib）、以及3代的劳拉替尼（Lorlatinib）。

外泌体ALK蛋白检测属于液态活检范畴，能反映患者体内ALK蛋白表达的真实状态，可以作为预后判断和用药指导。

目前，临床上针对ALK的检测有基因水平和蛋白水平的检测，基因检测主要通过实时荧光定量PCR、FISH、二代测序，蛋白检测主要针对FFPE组织的免疫组化检测。

实时荧光定量PCR的方法：先提取患者肿瘤组织中RNA，通过逆转录转化成cDNA，在扩增反应体系中加入ALK基因的相关引物和探针，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量，通过内参或者外参法对待测样品中的ALK序列进行定量分析。该方法操作步骤繁琐、耗时长、需要昂贵的荧光定量PCR仪，只能检测到已知的ALK融合基因。

二代测序的方法：先提取患者肿瘤组织中RNA或DNA，通过多重PCR的方法或探针捕获法进行文库构建，将合格的文库进行上机测序，将待测样本的测序数据对比到人类参考基因组，分析样本中是否含有ALK融合基因以及融合基因的比例。二代测序方法操作步骤繁琐、耗时长、成本高，需要核酸抽提，文库构建，测序等复杂的步骤，必须由专业的技术人员才能完成，不适合自动化操作。

FISH的方法：将离体的肿瘤组织依次进行固定、石蜡包埋、切片、烤片、脱蜡，采用ALK融合基因的探针杂交，染色之后，在荧光显微镜下判读阳性信号与阴性信号。该方法操作步骤繁琐、耗时长、价格高，只能检测到已知的ALK融合基因，灵敏度相对较低，且只能检测组织样本。