[发明专利]一种高效筛选具有植物茉莉素途径抑制功能的病原效应因子的方法

权利要求书

1.一种高效筛选具有植物茉莉素途径抑制功能的病原效应因子的方法，其特征在于，包括以下步骤：

构建双荧光素酶报告载体pVSP1-DL，并转入农杆菌中；

将待筛选的效应因子基因片段构建到植物双元超表达载体，并转入农杆菌中；

将含有报告载体的农杆菌与含有效应因子超表达载体的农杆菌混合，并注射烟草叶片；

使用LUC荧光素酶的底物喷施注射的烟草叶片，进行荧光成像；

对烟草注射部位取样，进行LUC和REN双荧光素酶酶活测定。

2.根据权利要求1所述的高效筛选具有植物茉莉素途径抑制功能的病原效应因子的方法，其特征在于，若烟草注射部位的LUC与REN酶活的比值显著低于注射报告载体与植物双元超表达载体p35S混合菌液的叶片区域的酶活的比值，则待筛选的效应因子具有抑制植物茉莉素途径的功能。

3.根据权利要求1所述高效筛选具有植物茉莉素途径抑制功能的病原效应因子的方法，其特征在于，构建得到的双荧光素酶报告载体中含有如下元件：茉莉素标志基因VSP1的启动子驱动的萤火虫荧光素酶基因，用于指示植物内源茉莉素途径激活水平；组成型启动子35S驱动的海肾荧光素酶基因，用作内参，用于平衡不同样品间农杆菌表达效率不同造成的误差。

4.根据权利要求1所述高效筛选具有植物茉莉素途径抑制功能的病原效应因子的方法，其特征在于，待筛选的效应因子基因为来源于微生物或昆虫的分泌蛋白编码基因。

5.根据权利要求1所述高效筛选具有植物茉莉素途径抑制功能的病原效应因子的方法，其特征在于，含有效应因子超表达载体的农杆菌与含有报告载体的农杆菌混合，含有报告载体的农杆菌终浓度为OD₆₀₀＝0.2，含有效应因子超表达载体的农杆菌终浓度为OD₆₀₀＝0.4。

6.根据权利要求5所述的高效筛选具有植物茉莉素途径抑制功能的病原效应因子的方法，其特征在于，调整农杆菌浓度所用缓冲液组成成分为：10mM MES，10mM MgCl₂，0.2mM乙酰丁香酮。

7.根据权利要求1所述高效筛选具有植物茉莉素途径抑制功能的病原效应因子的方法，其特征在于，注射农杆菌的烟草叶片在2-8天后喷施荧光素酶底物进行荧光成像。

8.根据权利要求1所述高效筛选具有植物茉莉素途径抑制功能的病原效应因子的方法，其特征在于，取样部位为注射了农杆菌的烟草叶片区域，取样时间为注射后2-8天。

9.根据权利要求1所述的高效筛选具有植物茉莉素途径抑制功能的病原效应因子的方法，其特征在于，将含有报告载体的农杆菌、含有效应因子超表达载体的农杆菌和p35S空载体的农杆菌分别划线活化后，挑单克隆于LB培养基中培养，离心收集菌体，去除培养基上清，所述LB培养基含有50mg/L利福平和100mg/L卡那霉素。

10.权利要求1～9任一项所述方法在病原微生物或昆虫防治中的应用。