[发明专利]一种高效筛选具有植物茉莉素途径抑制功能的病原效应因子的方法

说明书

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高效筛选具有植物茉莉素途径抑制功能的病原效应因子的方法，包括以下步骤：构建双荧光素酶报告载体pVSP1‑DL，并转入农杆菌中；将待筛选的效应因子基因片段构建到植物双元超表达载体，并转入农杆菌中；将含有报告载体的农杆菌与含有效应因子超表达载体的农杆菌混合，并注射烟草叶片；使用LUC荧光素酶的底物喷施注射的烟草叶片，进行荧光成像；对烟草注射部位取样，进行LUC和REN双荧光素酶酶活测定。本发明方法可以用简单快速的操作过程和低成本的仪器实现高效率、大批量的筛选抑制茉莉素途径的病原效应因子。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高效筛选具有植物茉莉素途径抑制功能的病原效应因子的方法。

背景技术

植物激素茉莉素在调控植物防御中发挥十分关键的作用。茉莉素合成或信号转导突变体对许多植物病原菌和昆虫的抗性显著低于野生型。已有研究表明，通过分泌效应蛋白进入植物细胞从而抑制植物茉莉素途径可能是病原菌和昆虫普遍采用的一种入侵策略。因此，通过筛选能够抑制茉莉素途径的病原菌或昆虫效应蛋白，可揭示病原菌或昆虫入侵的关键致病因子，为通过RNAi等方法进行病原菌或昆虫防治提供了靶点基因，具有重要的科学意义和实际应用价值。但以往主要通过构建转基因植物或者转基因菌株来研究病原菌或昆虫效应因子对植物茉莉素信号途径的影响。然而，此种方法耗时耗力，难以进行效应因子的大规模筛选。

发明内容

本发明目的在于提供一种高效筛选具有植物茉莉素途径抑制功能的病原效应因子的方法，本发明方法可以用简单快速的操作过程和低成本的仪器实现高效率、大批量的筛选抑制茉莉素途径的病原效应因子。

本发明提供的技术方案如下：

一种高效筛选具有植物茉莉素途径抑制功能的病原效应因子的方法，包括以下步骤：

1)构建双荧光素酶报告载体pVSP1-DL，并转入农杆菌中；

2)将待筛选的效应因子基因片段构建到p35S超表达载体，并转入农杆菌中；

3)将含有报告载体的农杆菌与含有效应因子超表达载体的农杆菌混合，并注射烟草叶片；

4)使用LUC荧光素酶的底物喷施注射的烟草叶片，进行荧光成像；

5)对烟草注射部位取样，进行LUC和REN双荧光素酶酶活测定。

进一步的，若烟草注射部位的LUC与REN酶活的比值显著低于注射报告载体与植物双元超表达载体p35S混合菌液的叶片区域，则待筛选的效应因子具有抑制植物茉莉素途径的功能。

进一步的，步骤1)中，构建得到的双荧光素酶报告载体中含有如下元件：茉莉素标志基因VSP1的启动子驱动的萤火虫荧光素酶基因(LUC)，用于指示植物内源茉莉素途径激活水平；组成型启动子35S驱动的海肾荧光素酶基因(REN)，用作内参，用于平衡不同样品间农杆菌表达效率不同造成的误差。

进一步的，步骤2)中，待筛选的效应因子基因为来源于微生物(包括病毒、细菌、真菌、卵菌等)或昆虫的分泌蛋白编码基因。

进一步的，步骤3)中，含有效应因子超表达载体的农杆菌需与含有报告载体的农杆菌混合后，再进行烟草注射。

进一步的，步骤4)中，注射农杆菌的烟草叶片在2-8天后喷施荧光素酶底物进行荧光成像。

进一步的，步骤5)中，取样部位为注射了农杆菌的烟草叶片区域，取样时间为注射后2-8天。