[发明专利]还原胺化酶及其制法和应用

说明书

本发明提供了还原胺化酶及其制法和应用。具体地，本发明涉及一种还原胺化酶及其功能鉴定及体外定向进化。本发明的还原胺化酶是来自卡利曲霉菌(Aspergillus calidoustus)的还原胺化酶AcRedAm及其突变体(包括对产物雷沙吉兰对映选择性显著提高的还原胺化酶突变体)。本发明还提供了体外还原胺化方法，包括步骤：(i)在还原胺化酶AcRedAm存在下，使得(S1)酮底物或醛底物与(S2)胺底物进行还原胺化反应。本发明的酶和突变体可用于体外酶法合成对映纯雷沙吉兰等不同的产物。

技术领域

本发明属于分子生物学和生物催化领域，具体地涉及还原胺化酶及其制法和应用。本发明提供了一种新型的还原胺化酶及其突变体，以及在合成雷沙吉兰等化合物中的应用。

背景技术

手性胺是众多天然产物、活性药物和其他高附加值化学品的重要组成部分。近年来，手性胺类药物约占FDA批准的新药的40％，其市场价值在2020年将近达到140亿美元。目前虽然许多用于制备手性胺的化学策略已经建立，但这些策略会受到诸如反应效率低、选择性低和不利环境发展等的限制。相比之下，来自可再生资源的酶可以提供出色的立体选择性和区域选择性，并在温和的水溶液条件下进行催化反应。另外，酶介导的生物催化还可以在不使用有毒试剂、不需要大量保护和去保护反应步骤的情况下进行，因此开发新型酶用作发展绿色化学的催化剂是当今生物合成催化领域的研究热点。

在过去的20年中，大量用于合成手性胺的酶催化途径已经被开发，其中催化前手性酮还原胺化为胺的转氨酶(TAs)、胺脱氢酶(AmDHs)和亚胺还原酶(IRED)都引起了科学家相当大的兴趣。但相关研究表明TAs和AmDHs目前都仅限于伯胺的合成，需要随后化学步骤的烷基化来合成手性仲胺和叔胺。而IRED虽然可以催化NAD(P)H依赖的前手性亚胺还原为手性胺，但其更偏好于还原环状亚胺底物，对前手性酮胺化的转化率比较低。

值得注意的是,Turner等人在2017年首次详细报道了来自米曲霉(Aspergillusoryzae)中的一种NADPH依赖性酶AspRedAm。该酶作为IRED的一个亚家族被命名为还原胺化酶(RedAm)，其可以在水性介质中催化更广泛的酮和胺的分子间还原胺化反应。与多步化学路线和其他生物催化剂(包括TA和AmDH)相比，还原胺化酶RedAm直接催化酮和胺分子缩合生成手性胺表现出相当高的效率，具有很高的原子经济节约性。特别是，AspRedAm能够直接催化1-茚酮和炔丙胺反应生成抗帕金森病药物(R)-雷沙吉兰，并且在某些情况下，AspRedAm在底物酮与胺的比例低至1:1的情况下仍显示出高反应活性。随后，该研究小组还报道了真菌来源的两种新型耐热RedAms，它们可以利用廉价的铵盐作为胺供体来生产伯胺并在温和条件下进行连续流动的生物转化。通过利用NADPH辅因子再生系统和多种胺作为氨基供体，RedAm催化的还原胺化过程可以最大限度地提高原子经济性，从而有助于环境可持续发展。这些研究结果表明，还原胺化酶(RedAm)具有突出的工业优势，和巨大的应用潜力。

目前，研究报道的还原胺化酶(RedAm)数量有限，难以满足对工业化应用的定制需求，因此本领域迫切需要开发新型还原胺化酶。

发明内容

本发明的目的就是提供一种新型还原胺化酶(RedAm)及其制法和应用。

在本发明的第一方面，提供了一种体外还原胺化方法，包括步骤：

(i)在还原胺化酶AcRedAm存在下，使得(S1)酮底物或醛底物与(S2)胺底物进行还原胺化反应。

在另一优选例中，所述方法包括：

在还原胺化酶AcRedAm存在下，使式Z1所示的酮底物或醛底物和式Z2所示的胺底物进行还原胺化反应，从而形成式I所示的还原胺化产物：

其中